[所屬分類:新聞動態] [發布時間:2019-10-21] [發布人:] [閱讀次數:] [返回]

山東拓普生物工程有限公司

Shandong Tuopu Biol-Engineering Co.,Ltd

中科院微生物所微生物資源前期開發國家重點實驗室杜文斌研究組和黃力研究組共同開發了一種新型的微流控界面納升注射技術（Interfacial Nanoinjection, INJ），該技術可以將傳統的生化反應體系微縮在一個納升體積的油包水微液滴體系中完成。針對這一技術創新，團隊申請了多項中國發明專利和美國專利，并研制了基于INJ技術的小型桌面系統。在儀器成本、耗材成本、最小液滴體積、流式細胞儀兼容性、操作的靈活性、以及污染控制等方面，均具有顯著優勢，適用于各類單細胞微體積反應分析，也可應用于其他微體積反應分析，在微生物培養篩選、合成生物學、藥物篩選、蛋白結晶條件篩選等方面均具有應用潛力。　

 　　在性能方面，INJ系統通過高精密度的微體積控制實現不同試劑組分的納升體積分步添加，兼容96和384孔板，可以在預先填裝礦物油的孔板上，按照程序設定加入納升樣品或試劑液滴，用于實現高通量篩選。利用低成本探針可以精確加注的最小體積達到1 nL，當加樣體積為5 nL時，體積標準偏差小于11 %。加注的液滴通過離心可以沉降到孔板底部并融合，液滴的融合效率最高，達到99%以上。利用多次加注樣品、試劑的方法，可以實現多步反應和濃度梯度配置。系統加注的體積精確性、線性和重現性良好。　　 

　　單細胞分析是一項變革性技術，在單細胞基因組異質性研究及復雜微生物群落中稀有微生物種群多樣性研究等領域應用廣泛。然而，如何進一步降低單細胞分析的成本，提高可靠性和效率，仍然面臨重大挑戰。流式細胞熒光激活細胞分選（FACS）是目前最高效的單細胞分選技術，可實現病毒、細菌、真菌和動物細胞的多參數檢測和分選；利用熒光標記，可對不同類型的細胞進行有效的區分，分選成功率高。研究團隊將INJ與FACS平臺相結合，建立了FACS-INJ單細胞分選分析流程，應用覆蓋了單細胞表型分析、基因型分析、基因表達分析以及全基因組擴增測序。

 　　研究團隊首先利用FACS-INJ系統實現了病原菌微生物單細胞耐藥基因的PCR篩查和單細胞藥敏表型篩查。經優化，多孔板可預先裝載納升體積的PCR引物或不同濃度的抗生素液滴。PCR篩查體積縮小到500 nL，試劑消耗和成本和常規體系相比降低至原先的1/40，耐藥檢測的體積控制在200 nL，試劑消耗和成本和常規體系相比降低至原先的1/1000，時間從>12小時縮短至5小時，這對于大幅降低臨床病原檢測的成本，實現腦脊液、房水等難獲取微量樣品的耐藥基因和表型篩查具有重要意義。

 　　其次，FACS-INJ系統還可用于動物細胞的單細胞基因表達分析。以小鼠巨噬細胞RAW264.7在細菌胞外多糖處理前后的炎癥反應為例，通過熒光激活流單細胞式分選處理前后的小鼠巨噬細胞，基于一步法反轉錄實時熒光PCR擴增，在單細胞水平解析了次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖基酶（HPRT）基因（看家基因）和白介素1β（IL-1β）基因（炎癥反應）表達水平的變化。

 　　最后，團隊與北京大學黃巖誼課題組合作，建立了基于FACS-INJ的微生物全基因組擴增測序流程，以獲得未培養微生物的全基因組信息。流程包括流式分選微生物單細胞、單細胞裂解、酸堿中和、MDA擴增和建庫測序。以熱泉來源的古菌硫化葉菌（Sulfolobus sp. A20）菌株為模型，將單細胞擴增的體積優化至360nL，硫化葉菌全基因組覆蓋度達到80%以上。在納升級微液滴中實現西南印度洋未培養單細胞微生物全基因組DNA的MDA擴增與測序，拼接后獲得15個單細胞基因組，大小在0.1~3.7Mb大小。該方法獲得的微生物基因組污染度較傳統的MDA擴增方法顯著降低（<5%），顯著提高了微生物單細胞基因組數據質量。平臺也適用于腫瘤、胚胎等動物細胞的全基因組擴增測序，對腫瘤細胞的單細胞測序的覆蓋度達到60-80%。