[所屬分類:新聞動態] [發布時間:2019-10-17] [發布人:] [閱讀次數:] [返回]

山東(dong)拓普生(sheng)物(wu)工(gong)程有限(xian)公(gong)司

Shandong Tuopu Biol-Engineering Co.,Ltd

基(ji)因編(bian)(bian)輯(ji)技(ji)術指能(neng)夠讓人類對目標基(ji)因進行“編(bian)(bian)輯(ji)”，實現(xian)對特定(ding)DNA片段的(de)敲除、加入等(deng)。而CRISPR/Cas9技(ji)術自問(wen)世以來(lai)，就有(you)著(zhu)其(qi)它(ta)基(ji)因編(bian)(bian)輯(ji)技(ji)術無可比擬的(de)優勢(shi)，技(ji)術不(bu)斷改進后，更被(bei)認為能(neng)夠在活(huo)細胞中最(zui)(zui)有(you)效(xiao)、最(zui)(zui)便捷地“編(bian)(bian)輯(ji)”任何(he)基(ji)因。基因編輯在生物醫藥和生命信息等領域中一直扮演著重要的角色，傳統的基因編輯技術由于構造困難因此在一定程度上阻礙了它的發展，而CRISPR/Cas9技術的問世則很好的克服了這一缺點。CRISPR/Cas9系統是細菌和古生菌的一種天然免疫系統。當外源核酸入侵時，Cas9蛋白就會在RNA的介導下定向切割核酸，發揮免疫功能。經過改造后的第三代基因編輯工具CRISPR/Cas9因其簡單，高效，低廉等優點為廣大科研工作者所利用。但即便如此，人們對Cas9蛋白的切割機制和切割后的修復機制還知之甚少。

在(zai)以往的(de)(de)(de)研究中，以CRISPR/Cas9領域的(de)(de)(de)權威杜德娜(na)（Doudna）和(he)夏龐(pang)蒂埃（Charpentier）為(wei)(wei)代表(biao)的(de)(de)(de)科學家們普(pu)遍認為(wei)(wei)Cas9只(zhi)能(neng)在(zai)PAM位點(dian)上游3堿基處切(qie)(qie)(qie)割(ge)DNA雙鏈產(chan)(chan)生平末端，并把在(zai)體外(wai)切(qie)(qie)(qie)割(ge)實驗中觀察到的(de)(de)(de)長(chang)短不(bu)一(yi)的(de)(de)(de)切(qie)(qie)(qie)割(ge)產(chan)(chan)物(wu)解釋(shi)為(wei)(wei)Cas9的(de)(de)(de)核酸(suan)外(wai)切(qie)(qie)(qie)酶(mei)活(huo)性(xing)(xing)。但近年來隨著研究的(de)(de)(de)深入，越(yue)來越(yue)多(duo)的(de)(de)(de)證據表(biao)明Cas9蛋白存在(zai)切(qie)(qie)(qie)割(ge)產(chan)(chan)生粘性(xing)(xing)末端的(de)(de)(de)活(huo)性(xing)(xing)。

雖然Cas9在PAM位點上(shang)游(you)4堿基(ji)處切(qie)割產(chan)生(sheng)粘性(xing)末端的活(huo)性(xing)已(yi)經得到了(le)承認，但對(dui)于(yu)Cas9是否存(cun)在其(qi)他的切(qie)割活(huo)性(xing)仍(reng)然存(cun)在爭議。

圍(wei)繞這一(yi)問題，吳強課題組(zu)致遠榮(rong)譽計劃(hua)2019級博士生石欣和博士后(hou)壽佳利用(yong)一(yi)對sgRNA對DNA片段進行(xing)編輯，并對重排接口進行(xing)了(le)高通量測序(xu)分析。結果表明不僅單堿(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)基(ji)的(de)插入(ru)(ru)存在(zai)著規律，兩(liang)堿(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)基(ji)甚至(zhi)三(san)堿(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)基(ji)的(de)插入(ru)(ru)也(ye)同樣存在(zai)著相似的(de)規律且這種插入(ru)(ru)可(ke)以精(jing)準預測：它(ta)們由(you)PAM位(wei)(wei)點上(shang)游(you)(you)-4，-5，-6位(wei)(wei)堿(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)基(ji)所決定。這種規律性(xing)(xing)的(de)兩(liang)堿(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)基(ji)，三(san)堿(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)基(ji)的(de)插入(ru)(ru)暗示SpCas9存在(zai)著PAM位(wei)(wei)點上(shang)游(you)(you)-5，-6位(wei)(wei)切割(ge)的(de)活(huo)性(xing)(xing)，這種新(xin)(xin)的(de)發(fa)現作為一(yi)種補充，不僅擴大了(le)人們對于SpCas9切割(ge)活(huo)性(xing)(xing)的(de)認(ren)知，還從另一(yi)側面(mian)驗(yan)證了(le)Cas9的(de)在(zai)PAM位(wei)(wei)點上(shang)游(you)(you)4堿(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)基(ji)處(chu)切割(ge)的(de)活(huo)性(xing)(xing)。至(zhi)此，吳強課題組(zu)修(xiu)改了(le)現有(you)的(de)模(mo)型(xing)，并提出(chu)了(le)新(xin)(xin)的(de)切割(ge)連接模(mo)型(xing)。

為了(le)進一(yi)(yi)步直觀地驗(yan)證這(zhe)種新(xin)的(de)(de)(de)切割(ge)(ge)(ge)活性(xing)，石欣和壽(shou)佳還(huan)進行了(le)體(ti)外切割(ge)(ge)(ge)實驗(yan)并對(dui)切割(ge)(ge)(ge)產(chan)(chan)物進行了(le)高通量(liang)測序(xu)分(fen)析，結(jie)果表明對(dui)于(yu)非互(hu)補鏈，Cas9切割(ge)(ge)(ge)后產(chan)(chan)生(sheng)了(le)不同長度的(de)(de)(de)突出(chu)末端(duan)的(de)(de)(de)切割(ge)(ge)(ge)產(chan)(chan)物，即(ji)產(chan)(chan)生(sheng)了(le)一(yi)(yi)個(ge)堿基，兩個(ge)堿基，三個(ge)堿基的(de)(de)(de)5’突出(chu)末端(duan)。而對(dui)于(yu)互(hu)補鏈，切割(ge)(ge)(ge)產(chan)(chan)物長度一(yi)(yi)致(zhi)。這(zhe)一(yi)(yi)體(ti)外實驗(yan)不僅更直觀地表明Cas9在非互(hu)補鏈PAM位(wei)(wei)點上游-4，-5，-6位(wei)(wei)的(de)(de)(de)切割(ge)(ge)(ge)活性(xing)，還(huan)對(dui)互(hu)補鏈的(de)(de)(de)切割(ge)(ge)(ge)只發生(sheng)在PAM位(wei)(wei)點上游3堿基處進行了(le)驗(yan)證。值得注意的(de)(de)(de)是，該(gai)研(yan)究第一(yi)(yi)次在體(ti)外切割(ge)(ge)(ge)實驗(yan)中直觀地證實了(le)Cas9的(de)(de)(de)產(chan)(chan)生(sheng)粘(zhan)性(xing)末端(duan)的(de)(de)(de)切割(ge)(ge)(ge)活性(xing)。

總之(zhi)，該研究(jiu)(jiu)(jiu)首次(ci)證明了(le)Cas9在非互(hu)補(bu)鏈(lian)PAM位(wei)點上游-5，-6的(de)切(qie)(qie)割(ge)活性，并否定(ding)了(le)此前(qian)認為的(de)不同(tong)長度的(de)切(qie)(qie)割(ge)產(chan)物是由于Cas9存在外(wai)切(qie)(qie)酶活性所致這一假設。不僅如此，該項(xiang)研究(jiu)(jiu)(jiu)還(huan)為精確(que)可控的(de)兩堿(jian)基、三堿(jian)基的(de)基因編輯(ji)(ji)奠(dian)定(ding)了(le)基礎，并為人類遺傳疾(ji)病的(de)治(zhi)療提供了(le)潛在的(de)方(fang)向。在基因編輯(ji)(ji)如火如荼的(de)今天，使用單個sgRNA切(qie)(qie)割(ge)造成基因失活早(zao)就成為常態，但(dan)利(li)用一對(dui)sgRNA對(dui)DNA大(da)片段進行編輯(ji)(ji)，并將其用于基因組元(yuan)件(jian)及染色質三維結(jie)構(gou)方(fang)面的(de)研究(jiu)(jiu)(jiu)還(huan)并未成熟。可以預見，該研究(jiu)(jiu)(jiu)不僅在基礎研究(jiu)(jiu)(jiu)領域發揮重大(da)作用，同(tong)時還(huan)有望推動對(dui)精確(que)基因編輯(ji)(ji)及細胞修復(fu)機制的(de)進一步(bu)深入(ru)理解(jie)。