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小RNA是怎樣切成的

[所屬分類:行業動態] [發布時間:2021-10-15] [發布人:網站管理員2] [閱讀次數:] [返回]
小RNA是怎樣切(qie)成的
作(zuo)者：辛雨 來(lai)源：中國(guo)科(ke)學報
研(yan)究揭示Dicer酶識(shi)別切割(ge)RNA機制
山東(dong)拓普生物工程有限公司  //ljxinglong.com
在(zai)(zai)包括人類(lei)在(zai)(zai)內的(de)高等真核生物中，有(you)一(yi)類(lei)長度約為19~30個堿基的(de)小RNA，在(zai)(zai)調控基因表達、抗病毒以及(ji)維持基因組穩定性等一(yi)系(xi)列重要生理過程(cheng)中起關鍵作用。
Dicer核(he)酸內切(qie)酶(mei)是小(xiao)RNA生物合成(cheng)的(de)核(he)心分子(zi)，小(xiao)RNA均為Dicer酶(mei)切(qie)割前體RNA而成(cheng)。不同(tong)(tong)小(xiao)RNA長度的(de)區別主要(yao)依賴于不同(tong)(tong)Dicer酶(mei)的(de)特(te)異性切(qie)割。
南方科技大(da)學教授杜嘉木聯合深圳大(da)學醫學部副(fu)教授李思思、美(mei)國加利福尼亞大(da)學Steven E. Jacobsen團隊以植物DNA甲基(ji)化(hua)通路中的(de)Dicer酶(mei)DCL3為(wei)研(yan)究對象，首次從(cong)整體層面解(jie)析了Dicer酶(mei)識別和切割(ge)RNA的(de)作用(yong)機制。相關研(yan)究成果發表(biao)于10月15日《科學》。
Dicer：重要(yao)又神奇的(de)酶(mei)
根(gen)據來(lai)源和功能不同(tong)，小(xiao)RNA可以(yi)分為很多類(lei)，不同(tong)種類(lei)的(de)小(xiao)RNA具備(bei)自己特定的(de)長度。如植物中負(fu)責(ze)轉基(ji)因(yin)沉默(mo)的(de)小(xiao)RNA是21-nt（核苷酸(suan)），而(er)負(fu)責(ze)調控DNA甲基(ji)化(hua)的(de)小(xiao)RNA則是24-nt。
杜嘉木(mu)告訴《中國科學報(bao)》：“這些區別(bie)產(chan)生的根源在于，小RNA的生成需(xu)要一類(lei)叫做Dicer的酶去切(qie)割前(qian)體RNA，而Dicer同時具備(bei)‘分(fen)子(zi)尺’和‘分(fen)子(zi)刀’的功能，可以(yi)測(ce)量產(chan)物RNA的長度(du)并定點切(qie)割前(qian)體RNA。”
值得注意的是(shi)，不(bu)同的Dicer酶可(ke)以(yi)測量(liang)并產(chan)生(sheng)不(bu)同長度(du)的小(xiao)RNA。因此，可(ke)以(yi)說(shuo)Dicer是(shi)小(xiao)RNA生(sheng)物合成的核(he)心分子，它直接確定了所產(chan)生(sheng)小(xiao)RNA的長度(du)、鏈特異(yi)性(xing)以(yi)及RNA的末端選(xuan)擇(ze)性(xing)等關鍵(jian)特征。
Dicer的分子作用機制(zhi)一直(zhi)小RNA領(ling)域的研(yan)究熱點，既往研(yan)究也獲取了Dicer在各(ge)個狀態(tai)(tai)下(xia)的結(jie)構。然而，Dicer是(shi)一個動態(tai)(tai)性非(fei)常(chang)強的酶。杜嘉木介紹(shao)，在催化(hua)過程(cheng)中，Dicer可以(yi)和多種輔助(zhu)因子結(jie)合，具備抓取前體RNA、將RNA放置到活性位點并開(kai)展定(ding)點切割等一系列動態(tai)(tai)過程(cheng)。
雖然，既往研究抓到(dao)了(le)很多(duo)Dicer的狀態(tai)，但(dan)是一(yi)直(zhi)沒有觀測到(dao)切割狀態(tai)下的Dicer是如(ru)何從一(yi)側(ce)抓取RNA的末端(duan)，并(bing)利用自身作為“分子尺”量取特定長度，隨后在RNA另一(yi)側(ce)定點(dian)切割。
杜(du)嘉木指出(chu)，此前Dicer切割機制(zhi)的研究(jiu)已積累了很多(duo)生化數據(ju)，為本研究(jiu)做(zuo)了重要(yao)鋪(pu)墊。如前期(qi)對DCL3的生化研究(jiu)發現，DCL3作(zuo)用機制(zhi)需要(yao)其前體(ti)RNA的先導鏈5’端(duan)第一(yi)個(ge)堿(jian)基是磷酸化的A，互補鏈3’端(duan)需要(yao)有(you)1-nt的末端(duan)突出(chu)，DLC3可以量(liang)取24-nt的小(xiao)RNA等。
無心插柳：抓到Dicer活性(xing)狀態
在植(zhi)物中，DNA甲(jia)(jia)基化(hua)的(de)從(cong)頭建(jian)立需要一個(ge)植(zhi)物特有的(de)信號(hao)系統——RNA指導(dao)的(de)DNA甲(jia)(jia)基化(hua)，這個(ge)系統中采用(yong)了長度為(wei)24-nt的(de)小RNA作為(wei)信號(hao)來介導(dao)DNA甲(jia)(jia)基化(hua)。
“植物利用(yong)Dicer家(jia)族成員DCL3特(te)異性生(sheng)(sheng)成24-nt的小(xiao)RNA來介(jie)導(dao)DNA甲基(ji)化。”杜嘉木強調，雖然這個通路在(zai)動物體內并不存在(zai)，但是動植物在(zai)基(ji)于Dicer的小(xiao)RNA生(sheng)(sheng)成方面的生(sheng)(sheng)化機(ji)制相(xiang)同(tong)。
研(yan)究人(ren)員在研(yan)究植物DNA甲基化時，非常幸(xing)運地抓到(dao)了DCL3的(de)活性狀態(tai)。
“我們發現DCL3幾乎沒有結合因子(zi)，而其自身的酶(mei)活(huo)性非常高，非常適(shi)合作為模型系統來(lai)研究Dicer的測量和切割(ge)機制(zhi)。”杜嘉木說。
為此(ci)，研究人員(yuan)在反應體系中(zhong)加了(le)鈣離(li)子，利用(yong)鈣離(li)子模擬鎂(mei)離(li)子催化抑制切(qie)(qie)(qie)割(ge)(ge)的作用(yong)，使DCL3處于(yu)結合RNA的狀態(tai)，又因離(li)子不(bu)同無法繼續切(qie)(qie)(qie)割(ge)(ge)，從而卡在切(qie)(qie)(qie)割(ge)(ge)前的活性狀態(tai)。
“結果(guo)正如我(wo)們預測(ce)，實驗中(zhong)DCL3-RNA復合物非常幸運(yun)地恰好處(chu)在(zai)Dicer的活(huo)性切割狀態，從(cong)而成功解析(xi)了DCL3識別和切割RNA的機(ji)制。”杜嘉木說。
杜嘉(jia)木表(biao)示，本研究在既往研究的基礎上(shang)，首次(ci)從整體(ti)層面將(jiang)這些元(yuan)素全(quan)部整合在一起并在機制(zhi)上(shang)予(yu)以解析。
“我們觀測到DCL3需要將前體RNA的(de)第一(yi)個(ge)堿基對(dui)打開(kai)，從(cong)而使前導鏈和互補鏈的(de)5’磷酸和3’末端突出(chu)，分別(bie)(bie)插入(ru)到Dicer的(de)兩個(ge)相鄰的(de)結合口袋，產生特異性識(shi)別(bie)(bie)。”杜(du)嘉(jia)木說。
李思思補充，基于RNA結(jie)構的(de)生化性質測定發現，DCL3對(dui)5’起始(shi)的(de)測量(liang)更加(jia)敏感(gan)，而對(dui)3’起始(shi)的(de)測量(liang)具備較高的(de)容(rong)錯性。“為了證明(ming)這(zhe)個推(tui)論，我們設(she)計出(chu)不同的(de)RNA并(bing)開展酶活實(shi)驗，并(bing)證實(shi)了Dicer確實(shi)更依賴于5’起始(shi)測量(liang)RNA的(de)機制(zhi)，證實(shi)了基于結(jie)構的(de)推(tui)論。”
在(zai)切割(ge)層面，該(gai)研(yan)究還首(shou)次觀測到了(le)(le)RNA處(chu)在(zai)Dicer的活性中心(xin)的構象(xiang)，觀測到了(le)(le)活性狀(zhuang)態Dicer扭曲RNA，并(bing)對RNA的前導鏈(lian)和互補鏈(lian)相(xiang)差2-nt同時切割(ge)的狀(zhuang)態，解釋(shi)了(le)(le)體(ti)內DCL3產物總是一條24-nt、另(ling)一條23-nt的原因。
“因為DCL3下游的(de)(de)(de)AGO4蛋白只(zhi)識(shi)別24-nt的(de)(de)(de)RNA，因此(ci)該結果也解釋了前期觀測到的(de)(de)(de)，RNA指導的(de)(de)(de)DNA甲基(ji)化中小RNA的(de)(de)(de)不對(dui)稱(cheng)性產生現(xian)象(xiang)。”杜嘉木(mu)說。
人(ren)造(zao)Dicer或許“觸手可(ke)及”
Dicer酶(mei)的作用機(ji)(ji)(ji)制是小RNA合成的核(he)心。該研(yan)究在(zai)解(jie)析植(zhi)物DCL3作用機(ji)(ji)(ji)制的過程中(zhong)，也(ye)大(da)量(liang)借鑒了動(dong)物Dicer研(yan)究的成果，從(cong)另一個(ge)側面展示出(chu)Dicer家族酶(mei)在(zai)機(ji)(ji)(ji)制層面具有相當強(qiang)的保守性。
李思思向《中國科學(xue)報》表示(shi)，小RNA是未來潛在(zai)(zai)的(de)疾病治(zhi)療手段(duan)，很多基于小RNA的(de)治(zhi)療策(ce)略正在(zai)(zai)研(yan)發中。
“人(ren)(ren)的(de)Dicer與很多疾病相關，也是目前(qian)基于RNA干擾(rao)療法的(de)核心。”杜嘉(jia)木表示(shi)，本研究不僅解析了植物(wu)DCL3特異性產生24-nt小RNA的(de)機制(zhi)，也在很大(da)程度上對動物(wu)Dicer、特別是人(ren)(ren)Dicer的(de)作(zuo)用(yong)機制(zhi)有(you)很大(da)的(de)提示(shi)作(zuo)用(yong)，這對未來RNA干擾(rao)療法的(de)發展及(ji)設計都有(you)非常(chang)重要的(de)意義。
目前，對Dicer-RNA互(hu)作機制的(de)(de)應用(yong)都(dou)是(shi)基于天然Dicer而設計的(de)(de)。李思思認為(wei)，如何避免(mian)內(nei)源(yuan)性(xing)Dicer的(de)(de)作用(yong)是(shi)關鍵問題。
基于該研(yan)究所(suo)揭示(shi)的(de)(de)Dicer-RNA互作(zuo)機制，使(shi)得人(ren)為(wei)改造設計人(ren)工Dicer-RNA成為(wei)可能(neng)。“這(zhe)樣，就可以在不影響體內Dicer正常(chang)工作(zuo)的(de)(de)情況下(xia)，選(xuan)擇性切割特定(ding)RNA，這(zhe)為(wei)未(wei)來Dicer的(de)(de)應用研(yan)究提(ti)供了一個新窗(chuang)口(kou)和(he)新思(si)路。”李思(si)思(si)說。
杜嘉木介紹，下一步，課題組將繼續設計不同的(de)RNA，力求(qiu)獲取DCL3抓到(dao)(dao)RNA以及將RNA放到(dao)(dao)活性位點前的(de)狀(zhuang)態(tai)，完整的(de)解析Dicer的(de)作用機制。
相(xiang)關論文信(xin)息：
//doi.org/10.1126/science.abl4546
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