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GB/T 18204.4-2025 公共場所衛(wei)生檢驗方法 第4部分：公共用品用具微生物(wu)指標

ICS 13.060
CCS C 51
中 華 人 民 共 和 國 國 家 標 準
GB/T 18204.4—2025
代(dai)替 GB/T 18204.4—2013
公共場所衛生檢驗方法
第4 部分: 公共用品用具微生物指標
Examination methodsfor public places—
Part 4: Microorganismindicators on asurface ofpublic articles
2025-05-30 發布 2025-12-01 實施
國 家 市 場 監 督 管 理 總 局
國 家 標 準 化 管 理 委 員 會 發 布
目 次
前(qian)言 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … Ⅲ
引言 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … Ⅳ
1 范圍(wei) … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 1
2 規范性引用文件(jian) … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 1
3 術語和定義 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 1
4 細(xi)菌總(zong)數(shu) … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 2
5 大(da)腸菌群 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 4
6 金黃(huang)色葡(pu)萄球菌 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 7
7 真菌(jun)總(zong)數… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 10
8 β-溶(rong)血性鏈(lian)球(qiu)菌 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 12
附錄 A (規范(fan)性) 公共(gong)場(chang)所公共(gong)用(yong)品用(yong)具微(wei)生(sheng)物采(cai)樣方(fang)法(fa) … … … … … … … … … … … … … … … … … 15
附錄 B (規范性) 質量控制和生物安(an)全(quan) … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 17
參考文(wen)獻 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 18
Ⅰ
GB/T 18204.4—2025
前 言
本文件(jian)按照(zhao) GB/T1.1—2020《 標準化工(gong)作導則 第(di)1 部分: 標準化(hua)文件的結構和起草規則》的規定
起草。
本文件是 GB/T18204《 公共場所衛(wei)生檢驗方法(fa)》的第4 部分。 GB/T18204 已經發布了以下部分:
———第1 部分: 物理性(xing)指標;
———第2 部分: 化學性指標;
———第(di)3 部分: 空氣微生物指標;
———第4 部分(fen): 公共(gong)用品用具微生物指標;
———第5 部分: 集中空調通風系統(tong);
———第6 部(bu)分: 衛生監(jian)測(ce)技術(shu)規范。
本文件代替 GB/T18204.4—2013《 公(gong)共(gong)場所(suo)衛生檢驗(yan)方法 第4 部分(fen): 公共(gong)用(yong)品用(yong)具微生(sheng)物》, 與
GB/T18204.4—2013 相比, 除結構調整和編輯性改動外, 主要(yao)技術變化如(ru)下:
a) 更改了術語和定義(見第3 章,2013 年版(ban)的第2 章) ;
b) 更改了部分(fen)儀器和耗材(cai)(見4.2、5.2、6.2、7.2 和8.2,2013 年版的(de)3.2、4.2、5.2、6.2 和 7.2) ;
c) 更改了(le)部分培養基和(he)試劑(見6.3 和8.3,2013 年版的5.1 和7.1) ;
d) 更(geng)改了檢驗步驟(見(jian)4.4、5.4、6.4、7.4 和8.4,2013 年版的3.3、4.3、5.3、6.3 和7.3) ;
e) 增(zeng)加(jia)了β-溶血性(xing)鏈球菌的觸酶試驗等生化(hua)鑒定方(fang)法(fa)(見8.4,2013 年版的7.3) ;

f)	更改了計算規則和結(jie)果報告(gao)(見4.6、4.7、5.5、6.5、7.6、7.7 和(he)8.5,2013 年版的3.5、3.6、4.4、5.4、 6.4、6.5 和7.4) ;

g) 更改了公(gong)共(gong)場所公(gong)共(gong)用品用具微(wei)生物采樣(yang)方法(見附(fu)錄(lu) A,2013 年版(ban)的附錄 A) ;
h) 增加了質量(liang)控制和生(sheng)物(wu)安全(見附(fu)錄 B) 。
請注意本文件的某些內容(rong)可(ke)能涉(she)及專(zhuan)利。 本文件的發布機(ji)構不承擔識別專(zhuan)利(li)的責(ze)任。
本文件由國家(jia)疾病預防控制局提出并歸口。
本文件起草單位(wei): 江蘇(su)省疾病預(yu)防控制中(zhong)心(xin)、 常(chang)州市疾病預防(fang)控制(zhi)中心、 南京市疾病(bing)預防控制中心、
蘇州市疾(ji)病預(yu)防控制(zhi)中心、 東(dong)南(nan)大學、 中國疾病預防(fang)控制中心環境(jing)與(yu)健康相(xiang)關產(chan)品安全所。
本文件主要起(qi)草(cao)人: 丁震、 馬(ma)愷、 馬小(xiao)瑩(ying)、 王鳳鳴(ming)、 雍瑋、 沈強、 錢華、 周志榮、 張付剛、 周連、 趙瑩。
本(ben)(ben)文(wen)件(jian)及其(qi)所代替文(wen)件(jian)的(de)歷(li)次版本(ben)(ben)發布情況為:
———1998 年首次 發 布 GB/T 17220—1998 《 公 共 場 所 衛 生 監 測 技(ji) 術 規 范》,2000 年 首 次 發 布

GB/T18204.2—2000 《 公共場所茶(cha)具微生物(wu)檢驗 方 法	細 菌(jun) 總(zong) 數 測(ce) 定》、GB/T 18204.3—
2000《 公共場所茶具微生物檢驗方(fang)法 大腸菌群(qun)測(ce)定(ding)》、GB/T 18204.4—2000《 公共場(chang)所毛巾、 床上臥具微生物檢驗方法 細(xi)菌總數測(ce)定》、GB/T 18204.5—2000《 公共場所(suo)毛巾、 床上臥具
微生物檢(jian)驗方(fang)法 大腸菌群測(ce)定(ding)》、GB/T18204.6—2000《 理發用具微生物檢驗方法	大腸菌
群(qun)測 定》、 GB/T 18204.7—2000 《 理 發 用 具 微(wei) 生(sheng) 物 檢(jian) 驗 方 法	金 黃 色 葡 萄 球 菌(jun) 測(ce) 定》、

GB/T18204.8—2000 《 公共場所拖(tuo)鞋微(wei)生物檢(jian)驗方法 霉菌(jun)和酵母菌(jun)測定(ding)》、GB/T18204.11—
2000《公(gong)共場所浴盆、臉(lian)(腳)盆(pen)微生物檢驗方(fang)法(fa) 細(xi)菌總數測(ce)定》、GB/T 18204.12—2000《 公共
場所浴盆、 臉(腳(jiao)) 盆微生物檢驗方法 大腸菌群測定》;
———2013 年 第(di) 一 次 修 訂 為 GB/T 18204. 4—2013, 代 替(ti) GB/T 18204. 2 ~ 18204. 8—2000、
GB/T18204.11~18204.12—2000, 部分代替 GB/T17220—1998;
———本次為第二次修訂。
Ⅲ
GB/T 18204.4—2025
引 言
GB/T18204《 公共場所衛生檢驗方法》是國家(jia)推薦(jian)性標準, 與 GB37488《 公共場所衛生指標及限值
要求》相配套使用, 是開展公(gong)共場所衛(wei)生監測推薦遵(zun)循(xun)的(de)標(biao)準檢驗方法。 GB/T 18204(所有部分) 的發
布有利于規范公共場所相關的樣品采集、 現場和(he)實驗室檢測, 提(ti)升(sheng)檢測(ce)機構檢測(ce)結果的精密度(du)、 準確度
和可比性, 為保(bao)障公共場所衛生(sheng)安全(quan)和人群健康(kang)提供(gong)重要(yao)支撐。 本文件(jian)是 GB/T18204 的第4 部分, 本
次修訂對 GB37488 中涉(she)及(ji)公共用(yong)品(pin)用(yong)具微生物指標的(de)檢驗方法進行了完(wan)善(shan), 補充了各項指標結果計
算、 質量控制要(yao)求, 增加(jia)了β-溶血性鏈(lian)球菌的生化鑒(jian)定步(bu)驟, 以進一步提高(gao)標準的先進性、 可操作性和
適用性, 滿足(zu)公共(gong)場所衛生檢驗(yan)需求。
GB/T18204 由6 個部分構(gou)成。
———第(di)1 部(bu)分: 物(wu)理性指標(biao)。 目的在于提供公共場所中的物理性指標的現場檢測的基本原則和
要求。
———第2 部分(fen): 化學性指(zhi)標(biao)。 目的在于提供公共場所中的化學性指標的樣品采集和實驗室檢測的
基本原則和要求。
———第3 部分: 空氣微生物指標。 目的在于提供公共場所中空氣微生物指標的樣品采集和實驗室
檢測的基本原則和要求。
———第(di)4 部(bu)分: 公共用品(pin)用具微生物(wu)指標。 目的在于提供公共場所中公共用品用具微生物指標的
樣品采集和實驗室檢測的基本原則和要求。
———第5 部分: 集中空調通風系統(tong)。 目的在于提供公共場所中集中空調通風系統指標的樣品采集
和實驗室檢測的基本原則和要求。
———第6 部(bu)分: 衛生監測技(ji)術規范。 目的(de)在于規范(fan)公共場(chang)所衛生監測的(de)頻次與樣本量(liang)、 質量控制等
技術要求。
Ⅳ
GB/T 18204.4—2025
公共場所衛生檢驗方法
第4 部分: 公共用品用具微生物指標
1 范圍
本文件(jian)描述了(le)公(gong)共(gong)場所公(gong)共(gong)用(yong)品用(yong)具表面細菌總數、 真菌總數(shu)、 大腸(chang)菌(jun)群、 金黃色葡(pu)萄球菌和β-溶
血性鏈球菌的采樣與檢驗方法。
本文件(jian)適用(yong)于公共(gong)場所公共(gong)用(yong)品(pin)用(yong)具微生(sheng)物指標的檢(jian)驗(yan), 其他場所(suo)參照執行。
2 規范性引用文件
下(xia)列文(wen)件(jian)中的(de)(de)內(nei)容(rong)通(tong)過文(wen)中的(de)(de)規范性(xing)引用(yong)而構成本文(wen)件(jian)必不可(ke)少的(de)(de)條款。 其中(zhong), 注日期的引用文
件, 僅該日期對應的版本(ben)適用于本(ben)文件; 不注(zhu)日期的引用文(wen)件, 其最(zui)新版(ban)本(包(bao)括所有的修(xiu)改單) 適用于
本文件。

GB4789.28 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 GB/T6682 分析(xi)實驗(yan)室用水規格(ge)和試驗(yan)方法(fa)	培養基和試劑的質量要(yao)求
GB19489 實驗室	生物安全(quan)通用要求

3 術語和定義
下列術語和定義適用于(yu)本文件。
3.1
細菌總數(shu) total bacterialcount
在(zai)營養瓊脂培(pei)養基上經(jing)36 ℃ ±1 ℃ 培養48 h 所生長發育的嗜中溫性需氧和兼性厭氧菌落的
總數。
3.2
大腸菌群 coliforms
在一定培養條件下能(neng)發酵乳糖、 產(chan)酸產(chan)氣的需氧和兼性(xing)厭氧革蘭氏(shi)陰(yin)性(xing)無芽孢桿菌。
3.3
金(jin)黃(huang)色葡(pu)萄球菌 staphylococcusaureus
在 Baird-Parker 平板上生長(chang)良(liang)好, 在(zai)血平板上可形成完全透明溶血環, 血漿凝固酶試驗陽性的革蘭
氏陽性球菌, 常(chang)呈葡萄(tao)球狀排(pai)列。
3.4
真菌總數 totalfungalcount
在(zai)沙(sha)氏瓊脂(zhi)培養基上經28 ℃ ±1 ℃ 、3 d~5 d 培養所形(xing)成的(de)菌落數(shu)。
3.5
β-溶血(xue)性鏈(lian)球(qiu)菌 β-hemolyticstreptococcus
能產生溶血素, 血平(ping)板上在菌落周圍形成界限分(fen)明、 完全透明的溶血環(β-型溶血(xue)) 的化膿( 或(huo) A
群) 鏈球菌和無乳(或 B 群) 鏈球菌(jun)。
[來源(yuan):GB4789.11—2014,2.2, 有修改]
1
GB/T 18204.4—2025
4 細菌總數
4.1 原理
在(zai)公共用品用具的適當部位(wei)來回均勻涂抹進行樣品采(cai)集, 樣(yang)品經過處理后, 在營養瓊脂培養基上經
36 ℃ ±1 ℃ 培養48 h 得到細菌菌落數的測定(ding)方法。
4.2 儀器和耗材
本方法中使用的(de)儀器(qi)和耗材如(ru)下:
———高(gao)壓蒸汽滅(mie)菌器(qi);
———干熱滅菌箱;
———恒溫培養箱:36 ℃ ±1 ℃ ;
———恒溫水浴箱(xiang):46 ℃ ±1 ℃ ;
———冰箱:2 ℃ ~5 ℃ ;
———電爐或微波爐;
———天平(ping): 感量0.1 g;
———渦(wo)旋混合器(qi);
———放大鏡或(和) 菌(jun)落計數(shu)器;
———無菌試管(guan):18 mm×150 mm;
———無菌平皿: 直徑90 mm;
———無菌刻度吸管(guan):1 mL(0.01 mL 刻度) ;
———微量移液器:1 000 μL;
———滅(mie)菌棉拭子(zi);
———滅菌剪刀;
———pH 計(ji)或精(jing)密pH 試紙。
4.3 培養基和試劑
4.3.1 無菌生理鹽水
4.3.1 .1 成分
氯化(hua)鈉8.5 g, 純水1 000 mL。 純水(shui)水(shui)質應符(fu)合 GB/T6682 中三級水或以上(shang)的要求。
4.3.1 .2 制法
稱(cheng)取8.5 g 氯化鈉溶于(yu)1 000 mL 純水中, 分(fen)裝到試管內, 每管10 mL 或9 mL,121 ℃ 高壓滅菌
15 min。
4.3.2 營養瓊脂培養基
4.3.2.1 成分
蛋白胨10.0 g, 牛肉(rou)膏3.0 g, 氯化鈉5.0 g, 瓊脂20.0 g, 純水1 000 mL。
4.3.2.2 制法
將上述成 分 混 合 后, 加 熱 溶 解, 調 節(jie) pH 為 7.4 ±0.2, 分 裝 于 瓶 裝 容 器 內,121 ℃ 高 壓 滅 菌
15 min, 儲存于冷暗處備用。
2
GB/T 18204.4—2025
4.4 檢驗步驟
樣品(pin)檢(jian)驗步驟(zou)按照以下操(cao)作(zuo)進(jin)行。
a) 采樣方法應符(fu)合附(fu)錄(lu) A 的要求。
b) 稀釋: 將放有采樣(yang)后棉拭子的生理鹽水試管在渦旋(xuan)混合器上充分(fen)振搖, 此液為1∶ 10 的樣品勻
液。 用1 mL 無(wu)菌吸管或微量移液器(qi)吸取1∶ 10 樣品勻(yun)液1 mL, 沿管壁緩慢注于盛9 mL 生
理鹽水稀釋液的無菌試管中(注意吸(xi)管或吸(xi)頭(tou)尖端不要觸(chu)及稀釋液(ye)面(mian)) , 振搖試管(guan)或(huo)換用1 支
無菌吸管反復吹打使其混合均勻, 制成(cheng)1∶ 100 的樣品勻液。 按同法制(zhi)備10 倍系列稀釋樣品
勻液, 每遞增稀(xi)釋1 次, 換用1 mL 無(wu)菌吸管或吸頭。
c) 接(jie)種: 根據樣(yang)品污(wu)染狀(zhuang)況, 選擇1 個~2 個適(shi)宜稀釋度的樣品(pin)勻液, 在(zai)進行 10 倍遞增稀釋
時, 每個(ge)稀釋度分別吸取1 mL 樣品(pin)勻液于(yu)2 個無菌平皿(min)內。 同時分別取(qu)1 mL 生理鹽水稀釋
液加入兩個無菌平皿作空白對照。
d) 培養: 及時將15 mL~20 mL 冷卻至45 ℃ ~50 ℃ 的營養瓊脂培養基(可放置于(yu)46 ℃ ±1 ℃ 恒
溫水浴箱中保溫) 傾注平(ping)皿, 并轉動平皿(min)使其(qi)混合均勻(yun), 瓊脂凝固(gu)后(hou), 將平皿翻轉,36 ℃ ±1 ℃
培養48 h±2 h。
4.5 菌落計數
4.5.1 可用肉眼觀察, 必(bi)要(yao)時用放(fang)大鏡或菌落計數器, 記錄稀釋倍數和相應的(de)菌落數量(liang)(CFU) 。
4.5.2 選取(qu)菌落數在30 CFU~300 CFU 之間、 無蔓延菌落生長(chang)的平板(ban)計數(shu)菌落總數(shu), 低于(yu)30 CFU 的
平板記錄具體菌落數, 大于(yu)300 CFU 的可(ke)(ke)記錄(lu)為多不可(ke)(ke)計(ji), 每個稀釋度的菌落數應采用兩個平板的平
均數。
4.5.3 其中一(yi)個平板(ban)有較大片(pian)狀菌落生長時, 則不宜采用, 而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度
的菌落數; 若片狀菌落(luo)不(bu)到平板的(de)一半, 而其余一半中菌落分布又很均勻, 即可(ke)計算半(ban)個(ge)平板后乘以2, 代
表一個平板菌落數。
4.5.4 平板(ban)內如有鏈(lian)狀菌落生長時(菌落之間無明顯(xian)界限) , 應將每條鏈(不同來源) 作為一個菌落計(ji)。
4.6 不同稀釋度菌落計數計算規則
4.6.1 若只有一個稀釋度平板上的菌落(luo)數(shu)(shu)在(zai)適宜計數(shu)(shu)范圍(wei)內, 計算兩個平(ping)板菌落數的平(ping)均值, 再將平
均菌落數乘以相應稀釋倍數, 作為樣(yang)本中菌(jun)落總數。
4.6.2 若有(you)兩個連續稀釋(shi)度的平板菌落數在適宜計數范圍內時, 則樣本中菌落總數按公式(shi)(1) 計算, 示
例見表1。
N = ∑C
(n1 +0.1n2 )d … … … … … … … … … …( 1 )
式中:
N ———樣(yang)本中菌落總(zong)數, 單(dan)位(wei)為菌落(luo)形成單(dan)位(wei)(CFU) ;
∑C ———平板(含適宜范(fan)圍菌落數(shu)的平板) 菌落(luo)數之和, 單(dan)位(wei)為菌落(luo)形成單(dan)位(wei)(CFU) ;
n1 ———適宜范圍菌(jun)落數的第一稀釋度(du)(低(di)) 平板個數;
n2 ———適宜(yi)范圍菌(jun)落(luo)數的第二稀釋度(高) 平板個數;
d ———稀釋(shi)因子(第一稀釋度) 。
3
GB/T 18204.4—2025
表1 兩個連續稀釋度的平板菌落數

稀釋度	1∶ 100(第一(yi)稀(xi)釋度)	1∶ 1 000(第二稀釋度)
菌落(luo)數	232,244	33,35

N =232 +244 +33 +35
(2 +0.1 ×2) ×10-2 =
544
2.2 ×10-2 =24 727
上述數據經(jing)“四舍五(wu)入”后, 表示(shi)為25 000 或2.5×104 。
4.6.3 若所(suo)有稀釋度的(de)平(ping)板(ban)上菌落數均(jun)大(da)于300 CFU, 對稀釋度(du)最高的(de)平板進行計數, 其他平板可記
錄為多不可計, 結果按平均菌落(luo)數乘(cheng)以最(zui)高稀釋倍數計算。
4.6.4 若所有稀釋度的平板(ban)菌(jun)落數(shu)均小(xiao)于30 CFU, 應(ying)按稀釋(shi)度最低的平均菌(jun)落數(shu)乘以稀釋(shi)倍數(shu)計算。
4.6.5 若(ruo)所有稀釋度平板均無菌(jun)落生長, 以小于1 乘(cheng)以(yi)最低稀釋倍數計算。
4.6.6 若所(suo)有稀釋(shi)度的平板菌(jun)落(luo)數均不在(zai)30 CFU~300 CFU 之間, 其中(zhong)一部(bu)分大于300 CFU 或小于
30 CFU 時, 則(ze)以最接(jie)近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落數(shu)(shu)乘以稀釋倍(bei)數(shu)(shu)計算。
4.7 結果報告
4.7.1 公共用(yong)品(pin)用(yong)具細菌總數的測定結果按(an)公式(2) 得出。
A =T ×b
k
… … … … … … … … … …( 2 )
式中:
A ———一定(ding)(ding) 面 積 的 細 菌 總 數 測 定(ding)(ding) 結 果 ( 杯 具 以 CFU/cm2 為 單 位 報 告, 其 他 公 共 用 品 用 具 以
CFU/25 cm2 為單位報(bao)告) ;
T ———平(ping)板平(ping)均菌落數, 單位(wei)為菌(jun)落形成單位(wei)(CFU) ;
b ———稀(xi)釋(shi)倍數;
k ———根(gen)據采樣面積、 標(biao)準限值單位得出的系數(杯具的(de)系(xi)數k 為50, 其(qi)他(ta)公共用品用具的系數(shu)k
為1) 。
若有(you)兩(liang)個連續稀釋度的平板(ban)菌落數在適(shi)宜計數范圍內, 則公(gong)式(2) 中的 T ×b 值為 4.6.2 中的
N 值。
4.7.2 菌落數小于100 CFU 時, 按“四舍(she)五入”原則修約, 以整(zheng)數報告。
4.7.3 菌(jun)落數大于(yu)或等于(yu)100 CFU 時, 第3 位數字采用(yong)“四舍五入”原則(ze)修約后, 取前(qian)2 位數字, 后面用
0 代替位數; 也(ye)可(ke)用10 的指數形式來表示(shi), 按“四(si)舍五入”原(yuan)則修約后(hou), 采用兩位有效數(shu)字(zi)。
4.7.4 若所有平板上為蔓延菌落(luo)而(er)無法計數, 則報告菌落(luo)蔓延。
4.7.5 若空(kong)白對照上有(you)菌落生長(chang), 則此次檢測結果(guo)無效(xiao)。
4.7.6 如果同一(yi)件(jian)用(yong)品(pin)采兩份樣品(pin), 當兩份(fen)樣品檢測結(jie)果不一致, 采用(yong)檢測(ce)值(zhi)高的結果報(bao)告。
4.8 質量控制和生物安全
應符合附(fu)錄 B 的要求。
5 大腸菌群
5.1 原理
在公共用品(pin)用具的(de)適當部位(wei)來回均勻涂抹(mo)進行樣品(pin)采集, 樣(yang)品經過處理后, 在乳糖膽鹽發酵培養液
4
GB/T 18204.4—2025
中(zhong)經36 ℃ ±1 ℃ 培養檢(jian)測(ce)大腸(chang)菌群的測(ce)定方法。
5.2 儀器和耗材
本方法中使用(yong)的儀器和耗材如下:
———高壓(ya)蒸汽(qi)滅(mie)菌器;
———干熱滅菌(jun)箱;
———恒溫(wen)培養箱:36 ℃ ±1 ℃ ;
———冰箱:2 ℃ ~5 ℃ ;
———電(dian)爐(lu)或微(wei)波爐(lu);
———天(tian)平: 感量0.1 g;
———渦旋混(hun)合器;
———顯(xian)微(wei)鏡;
———無菌(jun)接(jie)種環: 直徑3 mm;
———無菌試(shi)管:18 mm×150 mm;
———無菌(jun)平皿: 直徑90 mm;
———無菌(jun)刻(ke)度吸(xi)管:10 mL(0.1 mL 刻度) ;
———滅菌(jun)棉拭子;
———滅菌剪刀;
———pH 計或精密pH 試紙。
5.3 培養基和試劑
5.3.1 乳糖膽鹽發酵培養液
5.3.1 .1 成分
蛋白胨20.0 g, 豬膽鹽( 或(huo)牛(niu)、 羊膽鹽)5.0 g, 乳糖(tang)10.0 g, 溴甲酚紫水溶液(10 g/L)1 mL, 純水
1 000 mL。
5.3.1 .2 制法
將蛋白胨、 膽鹽及乳糖(tang)溶于純水中, 調(diao)節pH 至7.4, 加溴甲酚紫(zi)溶液(ye), 混勻(yun), 分裝到帶有倒管的試管
中, 每管10 mL,115 ℃ 高壓滅菌15 min。
注: 雙料乳糖膽鹽發酵培養液除純水外, 其他成分加倍。
5.3.2 伊紅美藍瓊脂
5.3.2.1 成分
蛋(dan)白胨10.0 g, 乳糖(tang)10.0 g, 磷酸氫二(er)鉀2.0 g, 瓊脂17.0 g, 伊紅水溶(rong)液(ye)(20 g/L)20 mL, 美藍水溶液
(5 g/L)13 mL, 純(chun)水1 000 mL。
5.3.2.2 制法
將蛋(dan)白胨、 磷 酸 鹽 和 瓊(qiong) 脂 溶(rong) 解 于 純 水 中, 調 節 pH 至 7.2, 分(fen) 裝(zhuang) 到(dao) 燒 瓶 內。 經 115 ℃ 高 壓 滅 菌
15 min, 臨用時(shi)加(jia)(jia)入乳糖并加(jia)(jia)熱溶化瓊脂, 冷(leng)卻至(zhi)50 ℃ ~55 ℃ , 加入(ru)伊紅(hong)和美藍(lan)溶液, 搖勻, 傾注平皿(min)。
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5.3.3 乳糖發酵管
5.3.3.1 成分
蛋白胨20.0 g, 乳(ru)糖10.0 g, 溴甲酚紫水溶液(ye)(10 g/L)1 mL, 純(chun)水1 000 mL。
5.3.3.2 制法
將蛋(dan)白胨及乳 糖 溶 于(yu) 純 水 中(zhong), 調 節 pH 至 7.4, 加 入 指(zhi) 示 劑(ji), 分 裝 到 帶 有 倒(dao) 管 的 試 管 中, 每 管
10 mL, 經115 ℃ 高(gao)壓(ya)滅菌15 min。
5.3.4 革蘭氏染色液
5.3.4.1 結晶紫染色液
5.3.4.1 .1 成分
結(jie)晶紫(zi)1.0 g, 乙醇(95%, 體積分數)20 mL, 草酸銨水溶液(10 g/L)80 mL。
5.3.4.1 .2 制法
將結晶紫完全溶解于乙醇中, 然后與草酸銨(an)溶(rong)液混(hun)合。
5.3.4.2 革蘭氏碘液
5.3.4.2.1 成分
碘1.0 g, 碘化鉀2.0 g, 純水300 mL。
5.3.4.2.2 制法
將碘(dian)與碘(dian)化鉀(jia)先行混(hun)合, 加入純水少許, 充分振搖(yao), 待完全溶解(jie)后, 再加(jia)純水。
5.3.4.3 脫色劑
乙醇(95%, 體積分數(shu)) 。
5.3.4.4 沙黃復染液
5.3.4.4.1 成分
沙黃0.25 g, 乙醇(95%, 體(ti)積(ji)分數)10 mL, 純(chun)水90 mL。
5.3.4.4.2 制法
將沙黃溶(rong)解(jie)于乙醇(chun)中, 待完全溶解后加(jia)入(ru)純水。
5.3.4.5 染色法
染色步驟按照以下操作進行:
a) 將培養(yang)18 h~24 h 的培養(yang)物涂片;
b) 將(jiang)涂片(pian)在火焰上固定, 滴加(jia)結晶紫染(ran)色液, 染(ran)1 min, 水(shui)洗;
c) 滴(di)加革(ge)蘭氏(shi)碘液, 作用1 min, 水洗;
d) 滴加乙(yi)醇脫(tuo)劑, 搖動(dong)玻片, 直至無紫(zi)色脫落為止(zhi), 約30 s, 水洗;
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e) 滴加復染液(ye), 復染1 min, 水洗, 待干, 鏡檢。
5.4 檢驗步驟
樣(yang)品檢驗步驟按(an)照以(yi)下操作進行。
a) 采樣方法應(ying)符合附(fu)錄 A 的要求。
b) 初發(fa)酵(jiao)試(shi)驗: 將放(fang)有采樣后(hou)棉(mian)拭子的生理鹽水試(shi)管在渦旋混合器上充分振(zhen)搖, 此液(ye)為1∶ 10 的
樣本勻液。 用(yong)無(wu)菌吸(xi)管(guan)吸(xi)取1∶ 10 的樣本勻液(多于1 mL) 注入雙料乳糖膽(dan)鹽發酵(jiao)培(pei)養液中。
置36 ℃ ±1 ℃ 培養(yang)箱內培養(yang)24 h±2 h, 觀察是否產酸(suan)、 產氣, 如不產酸(suan)、 不產氣則為大腸菌群
陰性。 若(ruo)有產氣產酸(suan)者, 則按c) ~e) 進行。
c) 分離培(pei)養: 自產酸、 產氣發酵管中取一接種(zhong)環培養液, 劃線(xian)轉(zhuan)種至伊(yi)紅美藍瓊(qiong)脂平板上, 倒置于
36 ℃ ±1 ℃ 培(pei)養箱中培(pei)養18 h~24 h, 觀察菌落形態, 典型菌落(luo)形(xing)態為深紫黑色、 具有金屬光
澤; 紫黑色、 不帶或略帶金屬(shu)光(guang)澤; 淡紫紅色、 中心較深。
d) 挑取伊紅美藍瓊脂平(ping)板上的典型菌落涂片(pian), 進行(xing)革(ge)蘭氏染色(se)鏡檢。
e) 挑取c) 中典(dian)型菌落接種乳糖發酵管, 置36 ℃ ±1 ℃ 培養24 h±2 h, 觀察(cha)是否產酸、 產氣。
5.5 結果報告
凡乳(ru)糖發酵管(guan)最終產酸、 產氣, 革(ge)蘭氏染色為陰(yin)性(xing)的無芽孢桿菌, 即可(ke)報告檢(jian)出大腸菌群(qun)。 如果同
一件用品用具采兩份樣品, 當(dang)兩份樣品檢測結果不一致時, 采用陽性檢(jian)測結(jie)果報告。
5.6 質量控制和生物安全
應(ying)符合附錄 B 的要求。
6 金黃色葡萄球菌
6.1 原理
采用涂抹法采樣(yang),7.5%氯化鈉肉(rou)湯增(zeng)菌,Baird-Parker 平板或血平板分離培養以及血漿凝固酶試驗
鑒定的方法測定公共用品用具中的金黃色葡萄球菌。
6.2 儀器和耗材
本方法中(zhong)使用(yong)的儀器和耗材(cai)如下:
———高(gao)壓蒸汽(qi)滅菌(jun)器;
———恒溫(wen)培養(yang)箱(xiang):36 ℃ ±1 ℃ ;
———恒溫水浴箱(xiang):36 ℃ ±1 ℃ ,50 ℃ ±1 ℃ ;
———冰(bing)箱(xiang):2 ℃ ~5 ℃ ;
———電爐或微(wei)波(bo)爐;
———天平: 感量0.1 g;
———酒精燈;
———生物安全(quan)柜;
———離心機;
———顯微鏡;
———載玻片;
———無(wu)菌接種環: 直(zhi)徑3 mm;
———無菌試管:18 mm×150 mm,13 mm×130 mm;
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———無(wu)菌平皿(min): 直徑 90 mm;
———無菌(jun)刻(ke)度(du)吸管:1 mL(0.01 mL 刻度) 、10 mL(0.1 mL 刻度(du)) ;
———微(wei)量(liang)移液(ye)器:1 000 μL;
———pH 計或精(jing)密pH 試紙。
6.3 培養基和試劑
6.3.1 7.5% 氯化鈉肉湯
6.3.1 .1 成分
蛋(dan)白胨10.0 g, 牛(niu)肉膏3.0 g, 氯(lv)化鈉(na)75.0 g, 純水1 000 mL。
6.3.1 .2 制法
將6.3.1.1 中(zhong)各成分(fen)加熱(re)溶解, 調節(jie)pH 至7.4±0.2, 分(fen)裝, 每支9 mL,121 ℃ 高壓滅菌15 min。
6.3.2 Baird-Parker 瓊脂平板
6.3.2.1 成分
胰蛋白胨10.0 g, 牛(niu)肉膏(gao)5.0 g, 酵(jiao)母浸膏1.0 g, 丙酮酸鈉10.0 g, 甘氨酸12.0 g, 氯化鋰(LiCl·
6H2O)5.0 g, 瓊脂(zhi)20.0 g, 純(chun)水(shui)950 mL。
6.3.2.2 增補劑
30%卵黃鹽水50 mL 與通過0.22 μm 孔徑濾(lv)(lv)膜進行過(guo)濾(lv)(lv)除菌后的1% 亞碲酸鉀(jia)溶(rong)液10 mL 混
合, 保存(cun)于2 ℃ ~5 ℃ 冰箱內。
6.3.2.3 制法
將(jiang)6.3.2.1 中各成分混合, 加熱(re)煮沸至完全溶解, 調節(jie)pH 至7.0±0.2。 分裝, 每瓶95 mL,121 ℃ 高
壓滅菌15 min。 臨用時加熱溶化瓊脂, 冷卻至50 ℃ , 每95 mL 加(jia)入預(yu)熱至50 ℃ 的增補劑(ji)5 mL, 搖勻
后立即在每個平皿傾注約15 mL~20 mL。 培養基應是致(zhi)密不透(tou)明(ming)的(de)。 如不及時使用(yong), 可在2 ℃ ~5 ℃
冰箱暫(zan)存。
6.3.3 血瓊脂平板
6.3.3.1 成分
蛋(dan)白(bai)胨10.0 g, 氯化鈉(na)5.0 g, 瓊脂(zhi) 20.0 g, 脫(tuo)纖(xian)維羊血 50 mL~100 mL, 純水 1 000 mL。
6.3.3.2 制法
脫纖維羊血: 在無(wu)菌操作條件下, 將羊血加(jia)入(ru)盛有滅菌玻璃珠的容(rong)器中, 振搖10 min 左(zuo)右, 靜置后
除去附有血纖維的玻璃珠即可。
將(jiang)蛋(dan)白(bai)胨、 氯化鈉、 瓊脂加熱(re)溶化于純水中, 校正 pH 為(wei)7.5 ±0.1,121 ℃ 15 min 滅菌。 待冷卻至
45 ℃ 左右, 以(yi)無(wu)菌操作(zuo)加(jia)入無(wu)菌脫纖維羊血, 搖(yao)勻后每皿傾注15 mL 培養基(ji)于平皿中(zhong), 制成血瓊脂平板
備用。
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6.3.4 腦心浸出液肉湯
6.3.4.1 成分
胰蛋白胨10.0 g, 氯化鈉5.0 g, 十二水合磷酸氫二鈉2.5 g, 葡萄(tao)糖2.0 g, 牛心浸出液500 mL。
6.3.4.2 制法
加熱溶解, 調節pH 至7.4±0.2, 分裝, 每支5 mL,121 ℃ 高壓滅菌15 min。
6.3.5 營養瓊脂小斜面
6.3.5.1 成分
蛋(dan)白(bai)胨10.0 g, 牛肉膏3.0 g, 氯化鈉5.0 g, 瓊脂20.0 g, 純水1 000 mL。
6.3.5.2 制法
將除瓊脂以外的各成分溶解于純(chun)水(shui)內, 加入15% 氫氧化鈉溶液(ye)約(yue)2 mL 調節pH 至7.3±0.2。 然
后加入瓊脂, 加(jia)熱煮沸, 使瓊(qiong)脂溶化, 分裝至13 mm×130 mm 試管(guan),121 ℃ 高(gao)壓滅(mie)菌(jun)15 min, 擺成斜面
備用。
6.3.6 兔血漿
6.3.6.1 成分
檸檬酸鈉3.8 g, 純水100 mL, 兔全(quan)血。
6.3.6.2 制法
將檸檬酸(suan)鈉溶于純水, 分裝,121 ℃ 高壓滅(mie)菌(jun)15 min。 取滅菌后(hou)3.8%檸(ning)檬酸鈉溶液(ye)1 份, 加兔全血
4 份, 混勻靜置(或(huo)以3 000 r/min 離(li)心30 min) , 使(shi)血細胞下(xia)沉, 取上層血漿。
6.3.7 革蘭氏染色液
見5.3.4。
6.4 檢驗步驟
樣品檢(jian)驗步(bu)驟(zou)按照(zhao)以下操作進行。
a) 采樣方(fang)法應符合附錄 A 的(de)要求(qiu)。
b) 增菌(jun): 將放有采(cai)樣后棉拭(shi)子的生(sheng)理(li)鹽(yan)水試管在渦旋(xuan)混合器上充(chong)分振搖, 用1 mL 無菌吸管或微
量移液器吸取1 mL, 接(jie)種到9 mL7.5%氯化鈉(na)肉湯中, 于36 ℃ ±1 ℃ 培養18 h~24 h。
c) 分離: 取1~2 接種(zhong)環(huan)增菌培養(yang)物, 劃線(xian)接種至 Baird-Parker 平板或(huo)血平板,Baird-Parker 平板
于36 ℃ ±1 ℃ 培養24 h~48 h, 血平板(ban)于36 ℃ ±1 ℃ 培養(yang)18 h~24 h, 觀察記(ji)錄菌(jun)落(luo)特(te)征。
在 Baird-Parker 平板上金黃色葡萄球菌(jun)(jun)菌(jun)(jun)落呈圓形、 光滑、 凸(tu)起、 濕潤(run), 菌落直徑為2 mm~
3 mm, 顏色(se)(se)呈灰黑色(se)(se)至黑色(se)(se), 邊緣整(zheng)齊(qi)、 常為淡(dan)色, 周(zhou)圍為一(yi)混濁帶, 在其外層(ceng)有(you)一(yi)透明帶。 偶
有不分解脂肪的菌株, 除(chu)沒有(you)混濁帶和透(tou)明帶之外, 其(qi)他外觀(guan)基本相(xiang)同。 在血平板上菌落較
大, 直徑(jing)為3 mm~5 mm, 呈圓形、 光滑、 凸起、 濕潤, 顏色呈金黃色(有(you)時為白色) , 菌落周圍通
常可見完全透明的溶血環。
d) 革蘭氏(shi)染色(se)鏡(jing)檢: 挑取典型(xing)菌(jun)落, 涂片、 革蘭氏染色, 顯微鏡下進(jin)行觀察。 金黃色葡萄球菌為革
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蘭氏陽性球菌, 排列呈(cheng)葡萄球狀, 無芽(ya)孢。
e) 血(xue)漿(jiang)凝(ning)固酶試(shi)驗: 挑取 Baird-Parker 平板或血(xue)平板上至少(shao)5 個可(ke)疑菌落(小于5 個全(quan)選) , 分別
接種到5 mL 腦心浸出液肉湯和營(ying)養(yang)瓊脂小斜面,36 ℃ ±1 ℃ 培養18 h~24 h。 取新鮮配制
的兔血漿0.5 mL, 放入(ru)小試管中, 再(zai)加入腦心浸出(chu)液(ye)肉湯培(pei)養物0.2 mL~0.3 mL, 振蕩搖
勻, 置于(yu)36 ℃ ±1 ℃ 培養箱或水浴箱內, 每30 min 觀察一次, 在6 h 內觀察(cha)結果(guo)。 如呈現凝固
(即將(jiang)試管傾斜(xie)或倒置時, 呈現凝塊) 或凝固體(ti)積大于(yu)原體(ti)積的一半(ban), 則判定為陽性(xing)結果(guo)。 同時
用已知血漿凝固酶試驗陽性和陰性的葡萄球菌標準菌株的肉湯培養物作為對照。 也可用商品
化的試劑, 按說明書操(cao)作, 進行(xing)血漿凝固(gu)酶試驗。 如(ru)結果可疑, 挑取營養瓊脂小斜面的菌落接
種到5 mL 腦心浸(jin)出液肉(rou)湯, 于36 ℃ ±1 ℃ 培養(yang)18 h~24 h, 重復試驗(yan)。 金黃色葡萄球菌血漿
凝固酶試驗為陽性。
6.5 結果報告
綜合以上試驗結(jie)果(guo), 報告樣(yang)品中檢(jian)出(chu)或未檢(jian)出(chu)金(jin)黃色葡萄球菌(jun)。 如果同一件用品用具采兩份樣
品, 當兩份樣(yang)品檢測結果不一致時, 采用陽(yang)性檢(jian)測結果報告。
6.6 質量控制和生物安全
應符合(he)附錄 B 的要求。
7 真菌總數
7.1 原理
在公共用品用具的適當(dang)部位(wei)來回(hui)均(jun)勻涂抹進行(xing)樣品采集, 樣品經過處理后, 在沙氏瓊脂培養基上經
28 ℃ ±1 ℃ 、3 d~5 d 培(pei)養得到真菌菌落(luo)數的測定方法。
7.2 儀器和耗材
本(ben)方法(fa)中使用的儀器和耗材如(ru)下(xia):
———高壓蒸汽滅菌器;
———恒溫培養(yang)箱:28 ℃ ±1 ℃ ;
———冰箱(xiang):2 ℃ ~5 ℃ ;
———電爐或微波爐;
———天平(ping): 感量0.1 g;
———渦旋混合器(qi);
———放大鏡或(和) 菌落(luo)計數器(qi);
———無菌試管:18 mm×150 mm;
———無菌平皿: 直徑(jing)90 mm;
———無菌刻度(du)吸管:1 mL(0.01 mL 刻度) ;
———pH 計或精密pH 試(shi)紙。
7.3 培養基和試劑
7.3.1 無菌生理鹽水
見4.3.1。
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7.3.2 沙氏瓊脂培養基
7.3.2.1 成分
蛋白胨(dong)10.0 g, 葡萄糖40.0 g, 瓊(qiong)脂20.0 g, 純(chun)水1 000 mL。
7.3.2.2 制法
將(jiang)蛋白(bai)胨、 葡萄糖和瓊(qiong)脂溶于純(chun)水中, 加熱溶解, 調節pH 為(wei)5.6±0.2, 分(fen)裝于瓶裝容器內, 分裝后
115 ℃ 高壓(ya)滅菌15 min, 儲存于冷暗處備(bei)用。
7.4 檢驗步驟
樣品(pin)檢驗(yan)步驟按照以下(xia)操作進行(xing)。
a) 采樣方法應符合(he)附錄 A 的要求。
b) 稀釋(shi): 參(can)照4.4 b) 。
c) 接種: 根據(ju)對樣品污(wu)染狀況的評估, 選擇2 個~3 個適宜(yi)稀釋度的樣(yang)品勻(yun)液。 在進行(xing)10 倍遞
增稀釋的同時, 每個稀釋度分別(bie)吸取1 mL 樣品勻(yun)液于2 個無菌平皿內。 同時分別取1 mL 無
菌稀釋液加入2 個(ge)無菌平皿作空(kong)白對照(zhao)。
d) 培養: 將溶化并冷卻至45 ℃ 左(zuo)右的沙(sha)氏瓊脂培養(yang)基傾(qing)注平皿(min)約20 mL~25 mL, 并轉動平皿使
其混合均勻, 待(dai)瓊(qiong)脂(zhi)凝固(gu)后, 倒置平(ping)皿(min)于28 ℃ ±1 ℃ 培養(yang)箱中(zhong)培養(yang)5 d, 逐日觀察并(bing)于第(di)5 天記
錄結果。 若(ruo)真菌數(shu)量過(guo)多可于第3 天計數結果(guo), 并記錄培養(yang)時間(jian)。
7.5 菌落計數
7.5.1 可用肉眼觀察, 必要(yao)時用放大(da)鏡或(huo)菌落計(ji)數器(qi), 記(ji)錄稀釋倍數(shu)和相應的菌落數(shu)量(CFU) 。
7.5.2 選擇菌落數在10 CFU~150 CFU 之間的(de)平皿(min)進行計數。
7.6 不同稀釋度菌落計數計算規則
7.6.1 若只有一(yi)個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內(nei), 計(ji)算兩個平板(ban)菌落數(shu)的平均值, 再將平
均菌落數乘以相應稀釋倍數, 作為樣本(ben)中真菌(jun)總數。
7.6.2 若有(you)兩個連續稀釋度(du)的平(ping)板菌落數在適宜計數范圍內時, 應參照4.6.2 的相關規定進行計算(suan)。
7.6.3 若(ruo)所有稀(xi)釋度的平板上菌落數均大于150 CFU, 對稀(xi)釋度最(zui)高的平板(ban)進行計(ji)數, 其他平板可記
錄為多不可計, 結果按平(ping)均菌(jun)落數乘以最高稀(xi)釋倍數計算。
7.6.4 若所有稀釋度(du)的(de)平板菌落數均小于10 CFU, 應按稀釋度(du)最(zui)低的平均菌(jun)落數(shu)(shu)乘以稀釋倍數(shu)(shu)計算。
7.6.5 若所有稀釋度平板(ban)均無菌落生長, 以小于1 乘以最(zui)低稀釋倍數計算(suan)。
7.6.6 若所有(you)稀釋度(du)的平(ping)板菌落數均不(bu)在10 CFU~150 CFU 之間, 其(qi)中(zhong)一部分大于150 CFU 或小于
10 CFU 時, 則以最接近10 CFU 或(huo)150 CFU 的平均(jun)菌落(luo)數乘以稀釋(shi)倍數計(ji)算(suan)。
7.7 結果報告
7.7.1 公共(gong)用(yong)品用(yong)具真(zhen)菌(jun)總(zong)數的測定(ding)結果(guo)按(an)公式(3) 得出(chu)。
A =T ×b
k
… … … … … … … … … …( 3 )
式中:
A ———一(yi)定(ding)面積(ji)的真(zhen)菌總數測(ce)定(ding)結果(以 CFU/50 cm2 為(wei)單位報告) ;
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T ———平板平均菌落數, 單位為菌落形(xing)成單位(CFU) ;
b ———稀釋倍(bei)數;
k ———根據(ju)采樣面積、 標準限值單(dan)位得出的系數(k =采樣面積
50 , 如采樣面積50 cm2 , 則k =1; 如采
樣面積25 cm2 , 則k =1/2) 。
若有兩(liang)個連續稀釋度的平板菌落數(shu)在(zai)適宜計(ji)數(shu)范圍內, 則公式(shi)(3) 中的 T ×b 值為(wei) 4.6.2 中的
N 值。
7.7.2 菌(jun)落(luo)數小于100 CFU 時(shi), 按“四舍五(wu)入(ru)”原則修(xiu)約(yue), 以整數報告。
7.7.3 菌(jun)落數大(da)于(yu)或等(deng)于(yu)100 CFU 時, 第3 位數字采用“四舍五入”原(yuan)則修約(yue)后(hou), 取前2 位數(shu)字, 后面用0
代替位(wei)數: 也(ye)可用10 的指數形式來表示, 按“四舍(she)五(wu)入”原則修約(yue)后, 采用兩位有效(xiao)數字。
7.7.4 若真菌蔓延(yan)生長(chang)覆蓋整個(ge)平板(ban)的可記(ji)錄(lu)為(wei)菌落蔓延(yan)。
7.7.5 若空(kong)白對照上有菌(jun)落生(sheng)長, 則此次(ci)檢測結(jie)果無效。
7.7.6 如果(guo)同一件用品采兩(liang)份(fen)樣(yang)品, 當兩份樣品檢測(ce)結果不一(yi)致時, 采用檢測值高(gao)的結(jie)果報告。
7.8 質量控制和生物安全
應(ying)符合(he)附(fu)錄 B 的要求。
8 β-溶血性鏈球菌
8.1 原理
采(cai)用涂抹法采(cai)樣, 改(gai)良胰蛋白胨大(da)豆肉(rou)湯增(zeng)菌, 血瓊脂平板分純培養并使用生化鑒定等方法檢測公
共用品用具中的β-溶血性鏈球菌。
8.2 儀器和耗材
本方(fang)法中使(shi)用的儀器和耗材如(ru)下:
———高(gao)壓蒸汽滅菌器;
———恒(heng)溫培(pei)養箱(xiang):36 ℃ ±1 ℃ ;
———厭氧培養裝置;
———冰箱:2 ℃ ~5 ℃ ;
———電爐或微波爐;
———天平: 感量0.01 g;
———顯(xian)微鏡;
———載(zai)玻片(pian);
———渦旋(xuan)混(hun)合器;
———微生(sheng)物生(sheng)化鑒(jian)定系統;
———無菌(jun)平皿: 直(zhi)徑90 mm;
———無菌刻度吸(xi)管:1 mL(0.01mL 刻度) 、10 mL(0.1 mL 刻度) ;
———微量(liang)移(yi)液(ye)器:1 000 μL;
———無菌錐形瓶: 容量(liang)200 mL、500 mL、1 000 mL、2 000 mL;
———pH 計或精密(mi)pH 試紙(zhi)。
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8.3 培養基和試劑
8.3.1 改良胰蛋白胨大豆肉湯(mTSB)
8.3.1 .1 基(ji)礎(chu)培養基(ji)[胰蛋白(bai)胨大豆肉湯(TSB) ]
8.3.1 .1 .1 成分
胰(yi)蛋白胨17.0 g, 大豆蛋白(bai)胨3.0 g, 氯化(hua)鈉5.0 g, 磷酸二氫(qing)鉀( 無水)2.5 g, 葡萄糖(tang)2.5 g, 純水
1 000 mL。
8.3.1 .1 .2 制法
將8.3.1.1.1 中(zhong)(zhong)各成分溶(rong)于純(chun)水中(zhong)(zhong), 加熱溶(rong)解, 校正(zheng)pH 至7.3±0.2,121 ℃ 滅(mie)菌(jun)15 min, 分裝備用(yong)。
8.3.1 .2 抗生素溶液
8.3.1 .2.1 多黏菌素溶液
稱取10 mg 多黏菌素 B 于(yu)10 mL 滅(mie)菌純水中, 振搖混勻, 充分溶(rong)解后(hou)過濾除菌。
8.3.1 .2.2 萘啶酮酸鈉溶液
稱(cheng)取(qu)10 mg 萘啶酮(tong)酸(suan)于10 mL0.05 mol/L 氫氧化鈉溶液中, 振搖(yao)混勻, 充分溶(rong)解后(hou)過(guo)濾除菌。
8.3.1 .3 完全培養基
8.3.1 .3.1 成分
胰(yi)蛋白胨大豆(dou)肉湯(TSB) 1 000 mL, 多黏菌素溶(rong)液 10 mL, 萘(nai)啶酮酸鈉溶液(ye) 10 mL。
8.3.1 .3.2 制法
無菌條件下, 將8.3.1.3.1 中各成分(fen)進行混合, 充分混勻, 分裝備(bei)用。
8.3.2 哥倫比亞 CNA 血瓊脂
8.3.2.1 成分
胰酪(lao)蛋(dan)白胨(dong)12.0 g, 動物組織蛋白消(xiao)化液(ye)5.0 g, 酵(jiao)母提取物3.0 g, 牛肉提(ti)取物3.0 g, 玉米淀粉
1.0 g, 氯化(hua)鈉(na)5.0 g, 瓊脂13.5 g, 多黏(nian)菌(jun)素0.01 g, 萘啶酸0.01 g, 純水1 000 mL。
8.3.2.2 制法
將 8.3.2.1 中各成分(fen)溶于純水中, 加熱溶(rong)解, 校(xiao)正 pH 至(zhi) 7.3 ±0.2,121 ℃ 滅菌 12 min, 待冷卻至
50 ℃ 左右時, 加 50 mL 無菌脫纖維綿(mian)羊血(xue), 搖勻后倒平板。
8.3.3 血瓊脂平板
見6.3.3。
8.3.4 革蘭氏染色液
見(jian)5.3.4。
13
GB/T 18204.4—2025
8.3.5 3%過氧化(hua)氫(H2O2 ) 溶液
8.3.5.1 成分
30%過氧(yang)化氫(qing)(H2O2 ) 溶液100 mL, 純水900 mL。
8.3.5.2 制法
吸取100 mL30%過氧化氫(H2O2 ) 溶液, 溶于純水中(zhong), 混勻(yun), 分裝備用(yong)。
8.3.6 生化鑒定試劑盒或生化鑒定卡
商品化試劑, 按說明書操作。
8.4 檢驗步驟
樣品檢驗步(bu)驟按照以下操作進行。
a) 采樣方法應符合附錄 A 的要求。
b) 增菌: 將放有采樣后棉(mian)拭子的生理鹽(yan)水試管在渦旋混合器(qi)上充分振(zhen)搖, 用無菌吸管或微量移液
器吸取液體檢樣1 mL, 接種到9 mL 改良胰蛋白胨(dong)大豆(dou)肉湯(tang)中, 于36 ℃ ±1 ℃ 培養(yang)18 h~
24 h。
c) 分離: 取1~2 接種環(huan)增菌(jun)培養物, 劃線接種(zhong)至哥倫比亞 CNA 血瓊脂平(ping)板,36 ℃ ±1 ℃ 厭氧培
養18 h~24 h, 觀察記錄菌落(luo)特征。 β-溶血性鏈球菌在哥倫比(bi)亞 CNA 血瓊脂平板上的典型菌
落形態為直徑約2 mm~4 mm, 灰(hui)白色、 半(ban)透明、 光滑、 表面突起、 圓形(xing)、 邊緣整(zheng)齊, 在菌落周圍
形成完全透明的溶血環, 紅細(xi)胞(bao)完全溶(rong)解。
d) 分純培養(yang): 挑取哥倫比(bi)亞CNA 血瓊脂平板(ban)上5 個(ge)(如小于5 個則全選) 典型菌落接種血瓊脂平
板,36 ℃ ±1 ℃ 培養18 h~24 h。
e) 革蘭氏(shi)染(ran)色鏡檢: 挑取血(xue)瓊脂平板上典型菌落染色鏡檢。 β-溶血性鏈球菌為革蘭氏染色陽
性, 呈(cheng)球形或卵圓(yuan)形, 常排列成短鏈狀(zhuang)。
f) 觸酶試驗: 挑取血(xue)瓊脂(zhi)平(ping)板上典(dian)型菌(jun)落于潔凈(jing)的載玻片上, 滴加適量3% 過氧化(hua)氫(qing)溶液, 于半
分鐘內有大量氣泡產生者為陽性, 不產生氣泡者為(wei)陰性,β-溶血(xue)性(xing)鏈(lian)球菌(jun)觸酶(mei)為陰性(xing)。
g) 生(sheng)化鑒定: 可使用商品化生化鑒(jian)定(ding)試劑盒或生化鑒(jian)定(ding)卡對典(dian)型(xing)菌落進行鑒(jian)定(ding)。
8.5 結果報告
綜合以上試(shi)驗結果, 在血瓊脂平板上呈灰白色菌落, 菌落(luo)透明或半透明, 在菌落周圍形成完全透明
的溶血環, 鏡(jing)檢(jian)為(wei)革蘭氏染色陽性(xing), 球形或卵圓形, 呈鏈(lian)狀(zhuang)排(pai)列, 觸酶(mei)試驗(yan)陰(yin)性, 可(ke)報告樣品中檢出β-溶
血性鏈球菌。 如(ru)果同一件用(yong)品(pin)用(yong)具采兩份樣品(pin), 當兩份樣品檢測結果不一致時, 采用陽性檢測結果
報告。
8.6 質量控制和生物安全
應符合附錄(lu) B 的(de)要求。
14
GB/T 18204.4—2025
附(fu) 錄 A
(規范性)
公共場所公共用品用具微生物采樣方法
A.1 概述
本(ben)附錄規定了公共(gong)場所公共(gong)用品(pin)用具微生物采樣的基本(ben)要求。
A.2 一般要求
A.2.1 隨(sui)機抽(chou)取清洗消(xiao)毒后待(dai)使用(yong)的公共用(yong)品用(yong)具。
A.2.2 采樣(yang)過程中應無菌操作。
A.2.3 采(cai)樣步(bu)驟(zou): 使(shi)用(yong)滅(mie)菌干燥棉拭子, 于10 mL 滅菌生(sheng)理鹽(yan)水內浸潤(吸取約(yue)1 mL 溶液) 后, 在用品
用具的適當部位來回均勻涂抹進行樣品采集, 將采集(ji)樣品(pin)后的棉拭子放入(ru)剩余(yu)的9 mL 生理鹽水內, 用
滅菌剪刀剪去棉簽手接觸的部分,4 h 內送檢。
A.3 采集部位與采樣面積
A.3.1 杯具
在杯具內、 外緣與口唇接觸處, 即1 cm~2 cm 高(gao)處各涂抹25 cm2 , 內外圈為1 份樣品(pin), 采樣總面積
為50 cm2 。
A.3.2 棉織品
A.3.2.1 將毛巾、 枕巾(枕套) 、 浴巾(jin)先對(dui)折后展(zhan)開, 在展(zhan)開平面上, 取對折線(xian)兩側中央對稱(cheng)位(wei)置5 cm×
5 cm (25 cm2 ) 面積范圍內分別均(jun)勻涂抹5 次, 每25 cm2 采樣面積為1 份樣品, 每件用品共(gong)采集2 份
樣品。
A.3.2.2 在床單、 被(bei)單(被(bei)套) 表面與頸部(bu)、 腳部接觸(chu)部位5 cm×5 cm(25 cm2 ) 面積范圍內分別均勻涂
抹5 次, 每(mei)25 cm2 采(cai)樣面(mian)積為1 份(fen)樣品, 每件用品(pin)共采集2 份(fen)樣品。
A.3.2.3 睡衣、 睡褲隨機選(xuan)擇 2 處與皮(pi)膚(fu)接觸部(bu)位 5 cm ×5 cm(25 cm2 ) 面積范圍內分別均勻 涂
抹5 次, 每25 cm2 采(cai)樣面積為1 份樣品, 每件用品(pin)共采集2 份樣品。
A.3.3 潔具
A.3.3.1 浴盆: 在(zai)浴(yu)盆(pen)內(nei)側壁二分之(zhi)一高度及盆(pen)底中央(yang)位(wei)置(zhi)5 cm×5 cm(25 cm2 ) 范圍內分別均勻涂抹
5 次, 每25 cm2 采(cai)樣面(mian)積為(wei)1 份(fen)樣品, 每件(jian)用品共采集2 份樣(yang)品。
A.3.3.2 臉(腳(jiao)) 盆: 在盆內壁二分之一高度, 相對稱的兩側壁(bi)處5 cm×5 cm(25 cm2 ) 范圍內分別均勻
涂抹5 次(ci), 每(mei)25 cm2 采樣(yang)面積(ji)為1 份樣品, 每件用品共采集2 份樣品。
A.3.3.3 坐(zuo)便(bian)器(qi): 在 坐 便 圈(quan) 前 端 彎 曲 處 相 對 稱 的 2 處(chu) 5 cm ×5 cm (25 cm2 ) 范 圍 內 分 別 均 勻 涂 抹
5 次, 每25 cm2 采樣面積為1 份樣品, 每件用品共采集2 份樣品。
A.3.3.4 按摩床(椅) : 在床(椅(yi)) 表面中部選(xuan)擇2 處與人體(ti)接觸部位(wei)5 cm×5 cm(25 cm2 ) 范圍內分別均
勻涂抹5 次(ci) , 每25 cm2 采樣面積為1 份樣品, 每件用品共采(cai)集2 份樣品。
A.3.4 鞋類
在每只鞋(xie)的鞋(xie)內與腳趾接觸處5 cm×5 cm(25 cm2 ) 面積(ji)范圍內分別均(jun)勻涂抹(mo)5 次, 每25 cm2 采
15
GB/T 18204.4—2025
樣面積為1 份(fen)樣品, 每(mei)雙鞋共采集2 份樣品(pin)。
A.3.5 購物(wu)車(筐)
車(筐) 把手: 在 把(ba) 手(shou) 1/3 與 2/3 手 易 接 觸 處 5 cm ×5 cm (25 cm2 ) 面 積 范 圍 內 分 別 均 勻 涂 抹
5 次(ci), 每25 cm2 采(cai)樣面積為1 份樣品, 每件(jian)用(yong)品(pin)共采集(ji)2 份樣品。
A.3.6 美容美發美甲用品
A.3.6.1 理(li)發(fa)推子: 在(zai)推子的前(qian)部(與皮膚接觸處) 均(jun)勻涂(tu)抹5 次, 采樣面積達到25 cm2 為1 份樣品(一
把理發推子采樣面積未達到25 cm2 的可加采其(qi)他理發推(tui)子) 。
A.3.6.2 理發刀、 剪(jian): 在刀、 剪兩個面各均勻(yun)涂抹5 次, 采樣(yang)面(mian)積達到25 cm2 為1 份樣(yang)品(一把理發刀、
剪的采(cai)樣面(mian)積未達(da)到(dao)25 cm2 的可加采其他理發刀、 剪(jian)) 。
A.3.6.3 美容美甲用品: 在美容美甲用品表(biao)面(與皮膚(fu)接觸處) 均勻涂抹5 次, 采樣(yang)面積達到25 cm2 為
1 份(fen)樣品(一套美容美甲用品的采樣面積(ji)未(wei)達到25 cm2 的可加采(cai)其他美容美甲(jia)用品) 。
A.3.7 修腳工具
在修腳工具表面(與皮膚接觸(chu)處(chu)) 均勻涂(tu)抹5 次, 采樣面積達(da)到25 cm2 為1 份樣(yang)品(一套修腳工具

的采樣(yang)面積未達到25 cm2 的可加采其他(ta)修腳工具) 。 A.3.8 其(qi)他用品

在用品表面(mian)選擇(ze)2 處與(yu)人體接觸(chu)處5 cm×5 cm(25 cm2 ) 面積范圍內(nei)分別采樣, 每25 cm2 采樣面
積為1 份樣品, 每件用品共采集(ji)2 份樣品。
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GB/T 18204.4—2025
附 錄(lu) B
(規范性(xing))
質量控制和生物安全
B.1 質量控制
B.1 .1 培養基和試劑需(xu)符合(he) GB 4789.28 的要求, 購買國內生產的成品培養基需有中國食品藥品監督
管理局批準的生產文號, 對于購(gou)買的(de)成(cheng)品培養基, 應在培(pei)養基有效期(qi)內使(shi)用(yong), 嚴格按照培養基要求的貯
存條件進行保存。
B.1 .2 確保所用試劑和材料為無菌狀態, 操作(zuo)過程(cheng)中避(bi)免(mian)人為污染。
B.1 .3 實驗用水的電導率在25 ℃ 時不應超過25 μS/cm( 相當于電(dian)阻率≥0.4 ΜΩ· cm) , 除非另有規
定要求。 水的微(wei)生物污染不應超過103 CFU/mL。
B.2 生物安全
實驗室生物安全(quan)應(ying)符合(he) GB19489 的要求, 實驗(yan)操(cao)作人(ren)員應掌握實驗(yan)室生物安全操(cao)作知識, 在處理
或檢測可疑致病菌時應采取必要的防護措施, 減少職(zhi)業暴露, 并保證符合國家有關法規(gui)規(gui)定的要(yao)求。
17
GB/T 18204.4—2025
參 考 文 獻
[1] GB4789.11—2014 食品安全國家標準(zhun) 食品微生物學檢驗 β 型溶血性鏈球菌檢
目 次
前(qian)言 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … Ⅲ
引言 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … Ⅳ
1 范圍 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 1
2 規范性引用文件 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 1
3 術語和(he)定義 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 1
4 細菌(jun)總(zong)數 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 2
5 大腸菌群 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 4
6 金黃色葡萄球(qiu)菌 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 7
7 真(zhen)菌總數(shu)… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 10
8 β-溶血性鏈球(qiu)菌 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 12
附錄 A (規范性) 公共(gong)場所公共(gong)用品用具(ju)微(wei)生物采樣方(fang)法 … … … … … … … … … … … … … … … … … 15
附錄 B (規范(fan)性(xing)) 質(zhi)量控制(zhi)和(he)生物安(an)全(quan) … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 17
參(can)考文(wen)獻 … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 18
Ⅰ
GB/T 18204.4—2025
前 言
本文(wen)件按照 GB/T1.1—2020《 標準化工作導則 第1 部(bu)分: 標準化(hua)文件的結構(gou)和起草規(gui)則》的規定
起草。
本(ben)文(wen)件是 GB/T18204《 公(gong)共場所衛生檢(jian)驗方法》的第4 部分。 GB/T18204 已經發布(bu)了以下部分(fen):
———第1 部分: 物理性指標(biao);
———第(di)2 部(bu)分: 化學性指標;
———第3 部(bu)分: 空氣(qi)微生物指標;
———第4 部分: 公共用(yong)品(pin)用(yong)具微生物指標;
———第(di)5 部分: 集中空調通風系統;
———第6 部(bu)分: 衛生監(jian)測技術規范。
本文(wen)件代替 GB/T18204.4—2013《 公共場所(suo)衛生檢驗方法(fa) 第4 部(bu)分: 公共用品用具(ju)微(wei)生物》, 與
GB/T18204.4—2013 相比, 除結構調整和編輯性改動外, 主要(yao)技術變化如下:
a) 更改了術語(yu)和定義(見第3 章,2013 年版的第2 章) ;
b) 更改了(le)部分儀器和(he)耗材(見4.2、5.2、6.2、7.2 和8.2,2013 年版的3.2、4.2、5.2、6.2 和 7.2) ;
c) 更(geng)改了部分培養基和(he)試劑(見6.3 和8.3,2013 年版的5.1 和7.1) ;
d) 更改了(le)檢驗(yan)步驟(見(jian)4.4、5.4、6.4、7.4 和(he)8.4,2013 年版的3.3、4.3、5.3、6.3 和7.3) ;
e) 增加了β-溶(rong)血(xue)性鏈(lian)球菌(jun)的觸酶試驗(yan)等生化鑒定(ding)方(fang)法(見8.4,2013 年(nian)版的7.3) ;

f)	更(geng)改了計算規則(ze)和結(jie)果報告(見4.6、4.7、5.5、6.5、7.6、7.7 和(he)8.5,2013 年(nian)版的(de)3.5、3.6、4.4、5.4、 6.4、6.5 和7.4) ;

g) 更改了公共(gong)場所公共(gong)用(yong)品用(yong)具微生物采(cai)樣(yang)方法(fa)(見附錄(lu) A,2013 年(nian)版(ban)的附(fu)錄 A) ;
h) 增加了(le)質量(liang)控制(zhi)和生物安全(見附錄 B) 。
請注意本文(wen)件的(de)某(mou)些內容可能涉及(ji)專(zhuan)利。 本文件的發布機構不承(cheng)擔識別專利(li)的責任。
本(ben)文件(jian)由國家疾病預防控制局提(ti)出并歸口。
本文件起草單位(wei): 江蘇省(sheng)疾病預(yu)防控制中心、 常州市疾病預防控制中(zhong)心、 南京(jing)市(shi)疾病預防控(kong)制中心、
蘇(su)州市疾(ji)病(bing)預防(fang)控(kong)制中心、 東南(nan)大學、 中國疾病預防(fang)控(kong)制中心環境與健康(kang)相(xiang)關(guan)產品(pin)安全所。
本文件主要起草(cao)人: 丁震、 馬愷(kai)、 馬小瑩(ying)、 王鳳鳴、 雍瑋、 沈強、 錢(qian)華、 周志榮(rong)、 張付剛、 周連、 趙瑩。
本文(wen)件及(ji)其所代替文(wen)件的歷次版本發布情況為:
———1998 年首次 發 布 GB/T 17220—1998 《 公 共 場 所 衛 生 監 測 技(ji) 術(shu) 規 范》,2000 年 首 次 發 布

GB/T18204.2—2000 《 公(gong)共場所茶(cha)具微生物檢驗 方 法	細 菌 總(zong) 數 測 定》、GB/T 18204.3—
2000《 公共場所茶(cha)具微生物檢驗方法 大腸(chang)菌群測定(ding)》、GB/T 18204.4—2000《 公共場所毛巾、 床上臥具微生物檢驗方法 細菌(jun)總數測定(ding)》、GB/T 18204.5—2000《 公共場所毛巾、 床上臥具
微(wei)生(sheng)物(wu)檢(jian)驗(yan)方法(fa) 大腸菌(jun)群測(ce)定》、GB/T18204.6—2000《 理發用具微生物檢驗方法	大腸菌(jun)
群測(ce) 定》、 GB/T 18204.7—2000 《 理 發 用 具(ju) 微 生(sheng) 物 檢 驗 方 法(fa)	金 黃(huang) 色 葡 萄 球 菌(jun) 測 定》、

GB/T18204.8—2000 《 公共場所拖鞋微生(sheng)物檢驗方法 霉菌(jun)和酵母菌(jun)測定》、GB/T18204.11—
2000《公共場所(suo)浴盆、臉(腳)盆微生物檢驗方法 細(xi)菌(jun)總數測(ce)定(ding)》、GB/T 18204.12—2000《 公共
場所浴盆、 臉(腳) 盆微(wei)生物檢驗(yan)方(fang)法 大腸菌群測定》;
———2013 年 第 一(yi) 次 修(xiu) 訂 為 GB/T 18204. 4—2013, 代 替 GB/T 18204. 2 ~ 18204. 8—2000、
GB/T18204.11~18204.12—2000, 部分(fen)代替(ti) GB/T17220—1998;
———本次為第二次修訂。
Ⅲ
GB/T 18204.4—2025
引 言
GB/T18204《 公共(gong)場所衛生檢驗(yan)方法(fa)》是國(guo)家推薦(jian)性標準, 與(yu) GB37488《 公共場所衛生指標及限值
要求》相配(pei)套使用(yong), 是開展公共場所衛生監測推薦遵循的標準檢驗方法。 GB/T 18204(所有部分) 的發
布有利于規范公共場所相關的樣品采集、 現場(chang)和(he)實驗室檢測, 提升檢測機(ji)構檢測結(jie)果的精密度、 準確度
和可比性, 為保(bao)障公共場所(suo)衛生(sheng)安全和人群健康提供重要支(zhi)撐。 本文件(jian)是 GB/T18204 的(de)第4 部分, 本
次修訂對 GB37488 中涉及公(gong)共用品用具(ju)微生物指標的檢驗方(fang)法進行了(le)完善, 補充了各項指標結果計
算、 質量控制(zhi)要求, 增加了β-溶血性鏈(lian)球菌(jun)的生化鑒定步驟(zou), 以進一步提高(gao)標準的(de)先進性、 可操作性和
適用性, 滿足公共場所衛生檢驗需求。
GB/T18204 由6 個部分構成。
———第1 部分: 物理性指(zhi)標。 目的在于提供公共場所中的物理性指標的現場檢測的基本原則和
要求。
———第2 部(bu)分: 化學性指(zhi)標。 目的在于提供公共場所中的化學性指標的樣品采集和實驗室檢測的
基本原則和要求。
———第3 部分: 空氣微(wei)生(sheng)物指標(biao)。 目的在于提供公共場所中空氣微生物指標的樣品采集和實驗室
檢測的基本原則和要求。
———第(di)4 部分: 公共用(yong)品用(yong)具微生物指標。 目的在于提供公共場所中公共用品用具微生物指標的
樣品采集和實驗室檢測的基本原則和要求。
———第5 部分(fen): 集中空調通風(feng)系統。 目的在于提供公共場所中集中空調通風系統指標的樣品采集
和實驗室檢測的基本原則和要求。
———第6 部分: 衛生監測技術(shu)規范。 目的在(zai)于(yu)規范公(gong)共場所衛生(sheng)監測的頻次(ci)與樣(yang)本量、 質量控制等
技術要求。
Ⅳ
GB/T 18204.4—2025
公共場所衛生檢驗方法
第4 部分: 公共用品用具微生物指標
1 范圍
本文件描述了(le)公共場所公共用(yong)品用(yong)具表面細菌總數、 真菌總數、 大腸菌群、 金黃色葡萄球菌和β-溶
血性鏈球菌的采樣與檢驗方法。
本文件適(shi)用于公共(gong)場所公共(gong)用品用具微生物指標的檢驗, 其他場所參照執(zhi)行。
2 規范性引用文件
下(xia)列文(wen)件中的內容通(tong)過文(wen)中的規范(fan)性引用而構成(cheng)本文(wen)件必不可少的條款(kuan)。 其中(zhong), 注日期的引用文
件, 僅(jin)該日期對應(ying)的版本適(shi)用(yong)于本文件; 不(bu)注日期的引(yin)用文件(jian), 其最新(xin)版本(包括所有的修改單) 適用于
本文件。

GB4789.28 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 GB/T6682 分析實驗(yan)室用水規格和試驗(yan)方(fang)法	培養基(ji)和試劑的質量要求
GB19489 實(shi)驗室	生物安(an)全通用要求

3 術語和定義
下列(lie)術語和定義適用于本(ben)文(wen)件。
3.1
細菌總數 total bacterialcount
在營養瓊脂(zhi)培養基(ji)上經36 ℃ ±1 ℃ 培養48 h 所生長發育的嗜中溫性需氧和兼性厭氧菌落的
總數。
3.2
大腸菌群 coliforms
在(zai)一定培養條件下能發酵乳糖、 產(chan)酸產(chan)氣的(de)需(xu)氧和兼(jian)性厭氧革蘭氏陰性無(wu)芽孢桿菌。
3.3
金黃色葡萄球菌 staphylococcusaureus
在(zai) Baird-Parker 平板上生長良好(hao), 在血(xue)平板(ban)上可形成完全透明溶血(xue)環, 血漿凝固酶試驗陽性的革蘭
氏陽性球菌, 常呈(cheng)葡萄(tao)球狀排(pai)列。
3.4
真菌(jun)總數 totalfungalcount
在沙氏瓊脂培養基上經28 ℃ ±1 ℃ 、3 d~5 d 培養(yang)所形成的菌落數。
3.5
β-溶血性鏈球(qiu)菌 β-hemolyticstreptococcus
能產生(sheng)溶血(xue)素, 血平(ping)板上(shang)在(zai)菌落周圍形成(cheng)界限分明(ming)、 完全透明的(de)溶血環(β-型溶(rong)血) 的化膿( 或 A
群) 鏈(lian)球菌(jun)和無(wu)乳(ru)(或 B 群) 鏈球菌(jun)。
[來源:GB4789.11—2014,2.2, 有修改]
1
GB/T 18204.4—2025
4 細菌總數
4.1 原理
在公共(gong)用品(pin)用具的適當部位來回(hui)均勻涂抹進行樣品(pin)采集, 樣品經過處理后, 在營養瓊脂培養基上經
36 ℃ ±1 ℃ 培(pei)養48 h 得到細菌菌落數的(de)測定(ding)方法。
4.2 儀器和耗材
本方(fang)法中使用的儀(yi)器和耗材如下:
———高壓蒸汽滅菌器;
———干熱滅菌箱;
———恒溫培養(yang)箱:36 ℃ ±1 ℃ ;
———恒溫水浴箱(xiang):46 ℃ ±1 ℃ ;
———冰箱:2 ℃ ~5 ℃ ;
———電爐或微波爐;
———天平: 感(gan)量0.1 g;
———渦旋混合器;
———放大鏡(jing)或(和(he)) 菌落計(ji)數(shu)器;
———無菌試(shi)管:18 mm×150 mm;
———無(wu)菌(jun)平(ping)皿: 直徑(jing)90 mm;
———無菌刻度吸管:1 mL(0.01 mL 刻度) ;
———微量移(yi)液器:1 000 μL;
———滅菌棉拭子;
———滅菌剪刀(dao);
———pH 計(ji)或精(jing)密pH 試紙(zhi)。
4.3 培養基和試劑
4.3.1 無菌生理鹽水
4.3.1 .1 成分
氯(lv)化(hua)鈉(na)8.5 g, 純水(shui)1 000 mL。 純(chun)水水質應符(fu)合 GB/T6682 中三級水或以(yi)上的(de)要求。
4.3.1 .2 制法
稱取(qu)8.5 g 氯(lv)化鈉溶于1 000 mL 純水中, 分(fen)裝(zhuang)到試管內, 每管10 mL 或9 mL,121 ℃ 高壓滅菌
15 min。
4.3.2 營養瓊脂培養基
4.3.2.1 成分
蛋(dan)白胨(dong)10.0 g, 牛(niu)肉膏(gao)3.0 g, 氯化鈉(na)5.0 g, 瓊(qiong)脂20.0 g, 純水1 000 mL。
4.3.2.2 制法
將上述成 分 混 合 后, 加 熱 溶 解, 調 節 pH 為 7.4 ±0.2, 分(fen) 裝(zhuang) 于 瓶 裝(zhuang) 容 器 內,121 ℃ 高 壓 滅 菌
15 min, 儲存于冷(leng)暗處備用。
2
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4.4 檢驗步驟
樣品檢(jian)驗步驟按照以下操作進行。
a) 采樣(yang)方法應(ying)符合(he)附錄 A 的要求。
b) 稀釋: 將(jiang)放有采樣后(hou)棉拭子的生(sheng)理鹽水試管在渦(wo)旋混合(he)器(qi)上充分振搖, 此液為1∶ 10 的樣品勻
液。 用1 mL 無菌吸(xi)(xi)管(guan)或微(wei)量移液器吸(xi)(xi)取1∶ 10 樣(yang)品勻液1 mL, 沿管(guan)壁緩慢注于盛9 mL 生
理鹽水稀釋液的無菌試管中(注意(yi)吸(xi)管或吸(xi)頭尖(jian)端不要觸(chu)及(ji)稀釋液面) , 振搖(yao)試管或換用1 支
無菌吸管反復吹打使其混合均勻, 制成(cheng)1∶ 100 的樣(yang)品勻液。 按同法制備(bei)10 倍系列稀釋樣品
勻液, 每遞增稀釋1 次, 換用1 mL 無菌吸(xi)管或吸(xi)頭(tou)。
c) 接種: 根據樣品污染狀況, 選(xuan)擇(ze)1 個~2 個適宜稀釋度的樣品勻液, 在(zai)進(jin)行 10 倍遞增稀釋
時, 每(mei)個(ge)稀(xi)釋度分(fen)別(bie)吸取1 mL 樣品勻(yun)液于2 個無菌(jun)平皿內(nei)。 同時分別取1 mL 生理鹽水稀釋
液加入兩個無菌平皿作空白對照。
d) 培養: 及時將15 mL~20 mL 冷卻至45 ℃ ~50 ℃ 的營養瓊脂培養基(可放(fang)置(zhi)于46 ℃ ±1 ℃ 恒
溫水浴箱中保溫) 傾注平皿, 并轉動平皿使(shi)其混合均勻, 瓊脂(zhi)凝固后, 將平皿翻轉,36 ℃ ±1 ℃
培(pei)養48 h±2 h。
4.5 菌落計數
4.5.1 可用肉眼觀察, 必要時用(yong)放大鏡或菌落計數器(qi), 記錄(lu)稀釋倍數(shu)和相應的菌(jun)落數(shu)量(CFU) 。
4.5.2 選取菌落數在30 CFU~300 CFU 之(zhi)間、 無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數, 低于30 CFU 的
平板記錄具體菌落數, 大于300 CFU 的可(ke)記錄為多不可(ke)計, 每個稀釋度的菌落數應采用兩個平板的平
均數。
4.5.3 其中一個平板有(you)較大片(pian)狀(zhuang)菌落生長時, 則(ze)不宜(yi)采用, 而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度
的菌落數; 若片狀(zhuang)菌(jun)落不到平板的(de)一半, 而其余一半(ban)中菌(jun)落分布又很均勻, 即可計算半個平板(ban)后乘以2, 代
表一個平板菌落數。
4.5.4 平板內如有鏈狀菌落生長時(菌落(luo)之(zhi)間無明顯界限) , 應將每條(tiao)鏈(不同(tong)來源) 作為(wei)一個菌落計。
4.6 不同稀釋度菌落計數計算規則
4.6.1 若只有一個(ge)稀釋度平板上的菌落數(shu)在適(shi)宜計數(shu)范(fan)圍內, 計(ji)算兩(liang)個(ge)平板(ban)菌落數的平均(jun)值, 再將平
均菌落數乘以相應稀釋倍數, 作(zuo)為(wei)樣本中(zhong)菌落總數。
4.6.2 若(ruo)有兩個(ge)連續稀釋(shi)度(du)的平板菌落(luo)數在適宜計數范圍內時, 則(ze)樣本中菌落總(zong)數按(an)公(gong)式(shi)(1) 計算, 示
例見表1。
N = ∑C
(n1 +0.1n2 )d … … … … … … … … … …( 1 )
式(shi)中:
N ———樣本中菌(jun)落總數, 單位為菌落形(xing)成單位(CFU) ;
∑C ———平(ping)板(含適(shi)宜范圍菌落數的平板) 菌落數之和, 單(dan)位(wei)(wei)為菌落形成單(dan)位(wei)(wei)(CFU) ;
n1 ———適宜范圍菌(jun)落數的(de)第一稀釋度(低) 平板個(ge)數;
n2 ———適宜范(fan)圍菌落數的第二稀釋度(高) 平(ping)板個數;
d ———稀釋因子(第一稀(xi)釋度) 。
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表1 兩個連續稀釋度的平板菌落數

稀釋度	1∶ 100(第一稀釋度)	1∶ 1 000(第二(er)稀釋度)
菌落(luo)數	232,244	33,35

N =232 +244 +33 +35
(2 +0.1 ×2) ×10-2 =
544
2.2 ×10-2 =24 727
上述數據經“四舍五(wu)入”后, 表示為25 000 或2.5×104 。
4.6.3 若所有稀釋(shi)度的(de)平板上菌落數均大于300 CFU, 對稀釋度最高的平板進行計(ji)數, 其他平板可記
錄為多不可計, 結(jie)果按平均菌落數乘以最高(gao)稀釋倍(bei)數計(ji)算。
4.6.4 若所有稀釋度的平板菌(jun)落數均(jun)小于30 CFU, 應按稀釋度(du)最(zui)低(di)的平均菌落數乘以稀釋倍(bei)數計算。
4.6.5 若所有稀釋度平(ping)板(ban)均無菌落生長, 以小于1 乘以最低稀釋倍數計算。
4.6.6 若所有稀釋度的平板菌(jun)落數均不在30 CFU~300 CFU 之(zhi)間, 其中一(yi)部分大于300 CFU 或小于
30 CFU 時(shi), 則以最接近30 CFU 或(huo)300 CFU 的平均菌(jun)落數(shu)乘以稀釋倍數(shu)計算(suan)。
4.7 結果報告
4.7.1 公(gong)共用(yong)品用(yong)具(ju)細(xi)菌總數的測定結(jie)果按公(gong)式(2) 得(de)出(chu)。
A =T ×b
k
… … … … … … … … … …( 2 )
式(shi)中:
A ———一定 面 積 的 細 菌(jun) 總(zong) 數(shu) 測 定 結 果 ( 杯 具(ju) 以 CFU/cm2 為 單 位 報 告, 其 他 公 共 用 品 用 具 以
CFU/25 cm2 為(wei)單位報(bao)告) ;
T ———平(ping)板(ban)平(ping)均菌(jun)落數, 單位為(wei)菌(jun)落形(xing)成單位(CFU) ;
b ———稀釋倍數;
k ———根據(ju)采樣面(mian)積(ji)、 標準限值單位得出的系數(杯具(ju)的系數k 為50, 其他公(gong)共(gong)用品用具(ju)的系數(shu)k
為1) 。
若有兩個(ge)連續稀(xi)釋度的平(ping)板菌落數(shu)(shu)在適宜計(ji)數(shu)(shu)范圍內, 則(ze)公式(shi)(2) 中的 T ×b 值為 4.6.2 中的
N 值。
4.7.2 菌落數小于(yu)100 CFU 時, 按“四(si)舍五(wu)入”原則修約, 以(yi)整數報告。
4.7.3 菌落數大于(yu)或等(deng)于(yu)100 CFU 時, 第3 位數(shu)字(zi)采用(yong)“四舍(she)五入”原(yuan)則(ze)修約后(hou), 取(qu)前2 位(wei)數字, 后面用
0 代替位數(shu); 也(ye)可用(yong)10 的指(zhi)數形式來表示, 按“四舍五(wu)入(ru)”原(yuan)則(ze)修約后, 采用兩位有效數(shu)字。
4.7.4 若所(suo)有平板上為(wei)蔓延菌落(luo)而無(wu)法(fa)計數, 則(ze)報告(gao)菌(jun)落(luo)蔓(man)延。
4.7.5 若空白(bai)對(dui)照上有菌落生長, 則(ze)此次(ci)檢(jian)測結果無效。
4.7.6 如果同一(yi)件用品采(cai)兩份(fen)樣(yang)品, 當(dang)兩份樣品檢測(ce)結果不一致, 采用檢測值高的(de)結果報告。
4.8 質量控制和生物安全
應符合附錄 B 的(de)要求。
5 大腸菌群
5.1 原理
在公共用品用具的適當部位來回均(jun)勻涂抹進(jin)行樣品采集, 樣(yang)品經(jing)過處理后, 在乳糖膽鹽發酵培養液
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中(zhong)經36 ℃ ±1 ℃ 培養檢測大腸菌群的測定方法(fa)。
5.2 儀器和耗材
本方法中使(shi)用(yong)的儀(yi)器和耗(hao)材如下:
———高壓蒸汽滅菌器;
———干熱滅(mie)菌箱;
———恒溫(wen)培養箱:36 ℃ ±1 ℃ ;
———冰箱:2 ℃ ~5 ℃ ;
———電(dian)爐或(huo)微波爐;
———天平: 感量0.1 g;
———渦旋混合(he)器;
———顯微鏡(jing);
———無菌接種環(huan): 直徑3 mm;
———無菌試管:18 mm×150 mm;
———無(wu)菌平皿(min): 直(zhi)徑90 mm;
———無菌(jun)刻度吸管:10 mL(0.1 mL 刻度(du)) ;
———滅菌棉拭子;
———滅菌剪刀;
———pH 計或精密(mi)pH 試(shi)紙。
5.3 培養基和試劑
5.3.1 乳糖膽鹽發酵培養液
5.3.1 .1 成分
蛋白胨20.0 g, 豬膽鹽(yan)( 或牛、 羊膽鹽)5.0 g, 乳(ru)糖10.0 g, 溴甲酚紫水溶液(10 g/L)1 mL, 純水
1 000 mL。
5.3.1 .2 制法
將(jiang)蛋白(bai)胨、 膽鹽及乳糖溶于純水(shui)中, 調節pH 至7.4, 加溴甲酚(fen)紫溶液, 混勻, 分裝到帶有倒管的試管
中, 每(mei)管(guan)10 mL,115 ℃ 高壓滅(mie)菌15 min。
注: 雙料乳糖膽鹽發酵培養液除純水外, 其他成分加倍。
5.3.2 伊紅美藍瓊脂
5.3.2.1 成分
蛋白胨10.0 g, 乳(ru)糖(tang)10.0 g, 磷酸氫二(er)鉀(jia)2.0 g, 瓊脂17.0 g, 伊紅水溶液(20 g/L)20 mL, 美藍水溶液
(5 g/L)13 mL, 純水1 000 mL。
5.3.2.2 制法
將蛋白胨、 磷(lin) 酸 鹽 和 瓊 脂 溶 解(jie) 于 純 水(shui) 中(zhong), 調(diao) 節 pH 至 7.2, 分 裝(zhuang) 到 燒 瓶 內。 經 115 ℃ 高 壓 滅 菌
15 min, 臨用時加入乳糖并加熱溶化瓊脂, 冷卻至50 ℃ ~55 ℃ , 加入伊紅和(he)美藍溶(rong)液(ye), 搖勻(yun), 傾注平(ping)皿(min)。
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5.3.3 乳糖發酵管
5.3.3.1 成分
蛋白(bai)胨20.0 g, 乳糖10.0 g, 溴甲(jia)酚紫(zi)水溶液(10 g/L)1 mL, 純水1 000 mL。
5.3.3.2 制法
將蛋白胨及乳 糖 溶 于 純 水(shui) 中, 調(diao) 節 pH 至 7.4, 加(jia) 入 指 示 劑, 分 裝 到 帶 有 倒 管(guan) 的 試(shi) 管(guan) 中, 每 管
10 mL, 經115 ℃ 高壓滅(mie)菌15 min。
5.3.4 革蘭氏染色液
5.3.4.1 結晶紫染色液
5.3.4.1 .1 成分
結晶紫1.0 g, 乙醇(95%, 體積分數)20 mL, 草(cao)酸銨水溶液(ye)(10 g/L)80 mL。
5.3.4.1 .2 制法
將結晶紫完全溶解于乙醇中, 然后與草(cao)酸(suan)銨溶(rong)液混合。
5.3.4.2 革蘭氏碘液
5.3.4.2.1 成分
碘1.0 g, 碘化鉀2.0 g, 純水(shui)300 mL。
5.3.4.2.2 制法
將碘與碘化鉀先(xian)行混合, 加入純水(shui)少許, 充分振(zhen)搖, 待(dai)完(wan)全(quan)溶解后, 再(zai)加純水。
5.3.4.3 脫色劑
乙醇(chun)(95%, 體積分(fen)數) 。
5.3.4.4 沙黃復染液
5.3.4.4.1 成分
沙黃0.25 g, 乙醇(chun)(95%, 體積分數)10 mL, 純水90 mL。
5.3.4.4.2 制法
將沙黃溶(rong)解于乙(yi)醇中, 待(dai)完全溶(rong)解后加入純水。
5.3.4.5 染色法
染色步驟按照以(yi)下操作進(jin)行:
a) 將培養18 h~24 h 的培養物涂片;
b) 將涂片(pian)在火焰上固定, 滴加結晶紫染色液, 染(ran)1 min, 水洗;
c) 滴加革蘭氏碘(dian)液, 作用1 min, 水洗;
d) 滴加乙醇脫劑, 搖動玻片(pian), 直至無(wu)紫色脫(tuo)落為(wei)止, 約30 s, 水洗;
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e) 滴加復染液, 復(fu)染1 min, 水(shui)洗, 待干, 鏡檢。
5.4 檢驗步驟
樣品檢驗步驟按照以(yi)下操作進行。
a) 采樣方法應符合附(fu)錄 A 的(de)要(yao)求(qiu)。
b) 初發酵試驗(yan): 將放有(you)采樣后(hou)棉拭(shi)子(zi)的生理鹽水試管在渦旋混合器上充分(fen)振(zhen)搖, 此液為1∶ 10 的
樣本勻液。 用無菌吸管吸取1∶ 10 的樣本勻液(多于1 mL) 注入雙料乳糖(tang)膽(dan)鹽(yan)發酵培養液中。
置36 ℃ ±1 ℃ 培(pei)養箱內培(pei)養24 h±2 h, 觀察是否產酸、 產(chan)氣, 如不產酸、 不產氣則為大腸菌群
陰性。 若有產(chan)氣產(chan)酸(suan)者, 則按c) ~e) 進行。
c) 分離培養: 自產酸(suan)、 產(chan)氣發酵管(guan)中取一接種環培養液, 劃線轉種至(zhi)伊紅(hong)美藍瓊脂(zhi)平板上, 倒置于
36 ℃ ±1 ℃ 培養箱中培養18 h~24 h, 觀察菌落(luo)形(xing)態, 典型菌落形(xing)態為深紫黑色、 具有金屬光
澤; 紫黑色、 不帶或略帶金屬光澤(ze); 淡(dan)紫紅色、 中心較深。
d) 挑取(qu)伊紅美藍瓊脂平板上的典型菌落涂(tu)片, 進行革蘭氏染色鏡檢。
e) 挑取(qu)c) 中典型菌(jun)落接種乳糖發酵管, 置(zhi)36 ℃ ±1 ℃ 培養24 h±2 h, 觀察是否產酸(suan)、 產氣。
5.5 結果報告
凡乳糖發酵管(guan)最(zui)終產酸、 產氣(qi), 革(ge)蘭氏染(ran)色為(wei)陰(yin)性(xing)的無芽(ya)孢(bao)桿菌, 即可(ke)報告檢出大腸(chang)菌群(qun)。 如果同
一件用品用具采兩份樣品, 當兩份(fen)樣品(pin)檢測結果不一致時(shi), 采用陽性檢測(ce)結果報告。
5.6 質量控制和生物安全
應符合(he)附錄(lu) B 的要求。
6 金黃色葡萄球菌
6.1 原理
采用涂抹法采樣,7.5%氯(lv)化鈉肉湯增菌(jun),Baird-Parker 平板或血平板分離培養以及血漿凝固酶試驗
鑒定的方法測定公共用品用具中的金黃色葡萄球菌。
6.2 儀器和耗材
本方法中使用的(de)儀器和(he)耗材如下:
———高壓蒸汽滅菌器;
———恒溫培養箱:36 ℃ ±1 ℃ ;
———恒溫(wen)水(shui)浴箱(xiang):36 ℃ ±1 ℃ ,50 ℃ ±1 ℃ ;
———冰(bing)箱:2 ℃ ~5 ℃ ;
———電爐或微波爐;
———天平: 感量0.1 g;
———酒(jiu)精燈(deng);
———生物安(an)全柜;
———離心機;
———顯(xian)微鏡;
———載玻(bo)片;
———無菌接種環: 直徑3 mm;
———無菌(jun)試管:18 mm×150 mm,13 mm×130 mm;
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———無菌平皿: 直徑 90 mm;
———無菌刻(ke)度吸管:1 mL(0.01 mL 刻度) 、10 mL(0.1 mL 刻(ke)度(du)) ;
———微(wei)量(liang)移液器:1 000 μL;
———pH 計(ji)或(huo)精密pH 試紙。
6.3 培養基和試劑
6.3.1 7.5% 氯化鈉肉湯
6.3.1 .1 成分
蛋白胨10.0 g, 牛肉膏3.0 g, 氯化鈉75.0 g, 純水1 000 mL。
6.3.1 .2 制法
將6.3.1.1 中各成分加熱溶解, 調節pH 至7.4±0.2, 分裝, 每支9 mL,121 ℃ 高壓(ya)滅菌(jun)15 min。
6.3.2 Baird-Parker 瓊脂平板
6.3.2.1 成分
胰蛋白胨10.0 g, 牛肉(rou)膏5.0 g, 酵母浸膏1.0 g, 丙酮酸鈉10.0 g, 甘(gan)氨(an)酸(suan)12.0 g, 氯化(hua)鋰(LiCl·
6H2O)5.0 g, 瓊脂20.0 g, 純水950 mL。
6.3.2.2 增補劑
30%卵黃鹽水50 mL 與通過0.22 μm 孔(kong)徑濾膜(mo)進行過濾除菌后的1% 亞碲(di)酸鉀溶液10 mL 混
合, 保存于2 ℃ ~5 ℃ 冰箱(xiang)內(nei)。
6.3.2.3 制法
將6.3.2.1 中(zhong)各成分(fen)混(hun)合, 加熱(re)煮沸至完全(quan)溶解, 調節(jie)pH 至7.0±0.2。 分裝, 每瓶95 mL,121 ℃ 高
壓滅菌15 min。 臨用時(shi)加熱溶化瓊脂(zhi), 冷卻至50 ℃ , 每(mei)95 mL 加入預熱(re)至50 ℃ 的增補劑(ji)5 mL, 搖勻
后立即在每個平皿傾注約15 mL~20 mL。 培養(yang)基應是(shi)致密不透明的(de)。 如不及時(shi)使用, 可(ke)在2 ℃ ~5 ℃
冰箱暫存。
6.3.3 血瓊脂平板
6.3.3.1 成分
蛋白胨10.0 g, 氯化鈉5.0 g, 瓊脂 20.0 g, 脫纖維羊血 50 mL~100 mL, 純水 1 000 mL。
6.3.3.2 制法
脫(tuo)纖維羊血: 在無菌操作條件(jian)下, 將羊血加入盛有(you)滅菌(jun)玻璃珠的容(rong)器中, 振搖10 min 左右, 靜置后
除去附有血纖維的玻璃珠即可。
將蛋白(bai)胨、 氯化鈉、 瓊脂(zhi)加熱溶化于純水中, 校正 pH 為(wei)7.5 ±0.1,121 ℃ 15 min 滅(mie)菌。 待冷卻至
45 ℃ 左右, 以無菌操作(zuo)加(jia)入無菌脫纖維羊血, 搖勻(yun)后每皿(min)傾注(zhu)15 mL 培(pei)養基(ji)于平皿中, 制成血瓊脂平板
備用。
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6.3.4 腦心浸出液肉湯
6.3.4.1 成分
胰蛋白(bai)胨10.0 g, 氯化鈉5.0 g, 十二水(shui)合磷(lin)酸氫二鈉(na)2.5 g, 葡萄糖2.0 g, 牛心浸出液500 mL。
6.3.4.2 制法
加(jia)熱溶解(jie), 調節(jie)pH 至7.4±0.2, 分裝, 每支(zhi)5 mL,121 ℃ 高壓滅菌15 min。
6.3.5 營養瓊脂小斜面
6.3.5.1 成分
蛋白胨10.0 g, 牛肉膏3.0 g, 氯化鈉5.0 g, 瓊(qiong)脂20.0 g, 純水1 000 mL。
6.3.5.2 制法
將除瓊脂以外的各成分溶解于純(chun)水內, 加入15% 氫氧(yang)化鈉(na)溶液約(yue)2 mL 調節pH 至7.3±0.2。 然
后加入瓊脂, 加熱(re)煮沸, 使瓊脂溶化, 分裝至13 mm×130 mm 試管,121 ℃ 高(gao)壓(ya)滅(mie)菌15 min, 擺成斜面
備用。
6.3.6 兔血漿
6.3.6.1 成分
檸檬酸鈉3.8 g, 純水100 mL, 兔全血(xue)。
6.3.6.2 制法
將檸檬(meng)酸鈉(na)溶于純水, 分裝,121 ℃ 高壓滅(mie)菌15 min。 取(qu)滅(mie)菌后3.8%檸檬酸鈉溶液1 份, 加兔全血
4 份, 混(hun)勻靜(jing)置(或(huo)以3 000 r/min 離心(xin)30 min) , 使血細胞下(xia)沉, 取上層血漿。
6.3.7 革蘭氏染色液
見5.3.4。
6.4 檢驗步驟
樣品檢(jian)驗步驟(zou)按(an)照以下操作進行。
a) 采樣方法應符合附錄 A 的要(yao)求(qiu)。
b) 增菌: 將放有(you)采樣后棉拭子的(de)生(sheng)理鹽(yan)水(shui)試管在渦旋混合器上充分振(zhen)搖, 用1 mL 無菌吸管或微
量移液器吸取1 mL, 接種(zhong)到9 mL7.5%氯(lv)化(hua)鈉(na)肉湯(tang)中(zhong), 于36 ℃ ±1 ℃ 培(pei)養18 h~24 h。
c) 分(fen)離: 取1~2 接種環(huan)增菌培養物, 劃線接種(zhong)至 Baird-Parker 平(ping)板或血平(ping)板,Baird-Parker 平板
于36 ℃ ±1 ℃ 培(pei)養24 h~48 h, 血(xue)平(ping)板于36 ℃ ±1 ℃ 培養18 h~24 h, 觀察記錄菌落特征。
在(zai) Baird-Parker 平板上金黃色葡(pu)萄球(qiu)菌菌落呈圓形、 光滑、 凸起、 濕潤, 菌落直徑(jing)為2 mm~
3 mm, 顏色(se)(se)呈灰黑色(se)(se)至(zhi)黑色(se)(se), 邊緣整齊、 常為淡色, 周(zhou)圍為一混濁(zhuo)帶, 在其(qi)外層有一(yi)透明(ming)帶。 偶
有不分解脂肪的菌株, 除沒有混濁(zhuo)帶(dai)和透明(ming)帶(dai)之外, 其他外觀基本相(xiang)同(tong)。 在血平板上菌落較
大, 直徑為3 mm~5 mm, 呈圓形、 光滑、 凸起(qi)、 濕潤, 顏(yan)色呈(cheng)金黃色(有時為白色(se)) , 菌落周圍通
常可見完全透明的溶血環。
d) 革蘭氏染色(se)鏡(jing)檢: 挑(tiao)取典型菌落, 涂(tu)片、 革蘭氏(shi)染色, 顯微鏡下進行觀察。 金黃色葡萄球菌為革
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蘭氏陽(yang)性球菌(jun), 排(pai)列呈葡(pu)萄(tao)球狀, 無芽孢(bao)。
e) 血漿凝固酶試驗(yan): 挑(tiao)取(qu) Baird-Parker 平板或血平板上至(zhi)少5 個可疑(yi)菌落(小于(yu)5 個全選) , 分別
接種到5 mL 腦心(xin)浸出(chu)液肉湯和營養瓊脂小斜面,36 ℃ ±1 ℃ 培(pei)養18 h~24 h。 取新鮮配制
的兔血漿0.5 mL, 放入小(xiao)試管(guan)中(zhong), 再加入腦心(xin)浸出(chu)液肉湯(tang)培養(yang)物(wu)0.2 mL~0.3 mL, 振蕩搖
勻, 置于36 ℃ ±1 ℃ 培養箱或(huo)水浴箱內(nei), 每30 min 觀察一次(ci), 在6 h 內觀(guan)察結果(guo)。 如呈現凝固
(即(ji)將試(shi)管傾斜或倒置時, 呈現凝塊) 或凝(ning)固體積(ji)大于(yu)原體積(ji)的一半, 則判(pan)定為陽性結果。 同時
用已知血漿凝固酶試驗陽性和陰性的葡萄球菌標準菌株的肉湯培養物作為對照。 也可用商品
化的試劑, 按(an)說明書操作(zuo), 進行血漿凝固(gu)酶試驗(yan)。 如(ru)結果可(ke)疑(yi), 挑取營養瓊脂小斜面的菌落接
種到5 mL 腦心浸出液肉湯, 于36 ℃ ±1 ℃ 培養(yang)18 h~24 h, 重復試驗。 金黃色葡萄球菌血漿
凝固酶試驗為陽性。
6.5 結果報告
綜合以上試驗結果, 報告樣品中檢出(chu)或未(wei)檢出(chu)金黃色葡萄球菌(jun)。 如果同一件用品用具采兩份樣
品, 當兩份樣品檢測結果不(bu)一致時, 采(cai)用陽性檢測結果報告。
6.6 質量控制和生物安全
應符合附(fu)錄 B 的要求。
7 真菌總數
7.1 原理
在公共用品(pin)用具的適當部位來回(hui)均(jun)勻涂(tu)抹進行樣品(pin)采集, 樣品(pin)經過處理后, 在沙氏瓊脂培養基上經
28 ℃ ±1 ℃ 、3 d~5 d 培養得到真菌(jun)(jun)菌(jun)(jun)落數的測定方(fang)法(fa)。
7.2 儀器和耗材
本(ben)方法(fa)中使用的儀器和耗材如下:
———高壓蒸汽滅(mie)菌(jun)器(qi);
———恒溫(wen)培養箱:28 ℃ ±1 ℃ ;
———冰箱(xiang):2 ℃ ~5 ℃ ;
———電爐或微(wei)波(bo)爐;
———天平: 感量0.1 g;
———渦旋混合(he)器;
———放大鏡或(和) 菌落(luo)計數器;
———無菌試(shi)管(guan):18 mm×150 mm;
———無菌平皿: 直(zhi)徑90 mm;
———無菌刻度(du)吸管(guan):1 mL(0.01 mL 刻(ke)度) ;
———pH 計或(huo)精密pH 試(shi)紙。
7.3 培養基和試劑
7.3.1 無菌生理鹽水
見4.3.1。
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7.3.2 沙氏瓊脂培養基
7.3.2.1 成分
蛋白胨(dong)10.0 g, 葡(pu)萄糖(tang)40.0 g, 瓊(qiong)脂20.0 g, 純水(shui)1 000 mL。
7.3.2.2 制法
將蛋白胨、 葡萄糖和瓊脂溶于純水中, 加(jia)熱(re)溶(rong)解, 調節pH 為5.6±0.2, 分裝(zhuang)于(yu)瓶裝(zhuang)容器內(nei), 分裝后
115 ℃ 高壓滅菌15 min, 儲(chu)存于冷暗處備用。
7.4 檢驗步驟
樣(yang)品檢驗(yan)步驟按照以下操作進行。
a) 采樣方法(fa)應符合附錄 A 的要求。
b) 稀釋: 參照4.4 b) 。
c) 接種(zhong): 根(gen)據(ju)對(dui)樣品(pin)污(wu)染(ran)狀況的評估, 選(xuan)擇2 個~3 個適(shi)宜(yi)稀釋度的樣品勻液。 在進行(xing)10 倍遞
增稀釋的同時, 每(mei)個稀(xi)釋(shi)度(du)分別吸(xi)取1 mL 樣品勻液于(yu)2 個無(wu)菌平皿(min)內。 同(tong)時分(fen)別取1 mL 無
菌稀釋液加入2 個(ge)無菌(jun)平皿(min)作空白對照。
d) 培養: 將溶化并冷(leng)卻至45 ℃ 左右的沙氏(shi)瓊脂培養基傾(qing)注平皿約20 mL~25 mL, 并轉動平皿使
其混合均勻, 待瓊脂凝固后, 倒置平皿(min)于28 ℃ ±1 ℃ 培(pei)(pei)養(yang)箱中培(pei)(pei)養(yang)5 d, 逐日(ri)觀察(cha)并于(yu)第(di)5 天記
錄結果。 若真(zhen)菌數量過多可于第(di)3 天計數結果, 并記錄培養時間。
7.5 菌落計數
7.5.1 可用肉眼(yan)觀察(cha), 必要時用放(fang)大鏡或(huo)菌落計數器, 記錄稀釋倍數(shu)(shu)和相應的菌落數(shu)(shu)量(CFU) 。
7.5.2 選擇菌落數在10 CFU~150 CFU 之(zhi)間(jian)的平皿(min)進行計數。
7.6 不同稀釋度菌落計數計算規則
7.6.1 若只(zhi)有一個稀(xi)釋度平板(ban)上的菌落(luo)數(shu)在適宜計數(shu)范(fan)圍內, 計算(suan)兩(liang)個平(ping)板菌(jun)落數的平(ping)均值, 再將平
均菌落數乘以相應稀釋倍數, 作(zuo)為樣本中真(zhen)菌(jun)總數。
7.6.2 若有兩(liang)個(ge)連續稀釋(shi)度的平(ping)板菌落數(shu)在適宜計數(shu)范(fan)圍內時(shi), 應參照(zhao)4.6.2 的相關規定進行計算。
7.6.3 若所有稀(xi)釋度(du)的平板上(shang)菌(jun)落數(shu)均大(da)于150 CFU, 對稀釋度(du)最高(gao)的平(ping)板(ban)進(jin)行計數, 其他平板可記
錄為多不可計, 結果按平均菌落(luo)數(shu)乘(cheng)以(yi)最高稀釋倍數(shu)計算(suan)。
7.6.4 若(ruo)所有稀(xi)釋度(du)的平板菌落數均小于10 CFU, 應按稀(xi)(xi)釋(shi)度最低的平均菌落數乘以(yi)稀(xi)(xi)釋(shi)倍數計算。
7.6.5 若(ruo)所有稀釋度平板(ban)均無菌(jun)落生(sheng)長, 以小于1 乘以最(zui)低稀釋倍(bei)數(shu)計算(suan)。
7.6.6 若所有稀(xi)釋(shi)度的平板菌落數均不(bu)在10 CFU~150 CFU 之間, 其(qi)中一(yi)部分大于(yu)150 CFU 或小于
10 CFU 時(shi), 則以(yi)最接(jie)近10 CFU 或150 CFU 的平均菌落數(shu)乘以(yi)稀釋倍數(shu)計算(suan)。
7.7 結果報告
7.7.1 公共用品用具真(zhen)菌(jun)總數的測定結果按公式(3) 得出。
A =T ×b
k
… … … … … … … … … …( 3 )
式中:
A ———一定面積的真菌總(zong)數測定結(jie)果(guo)(以 CFU/50 cm2 為單位(wei)報告(gao)) ;
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T ———平板平均菌(jun)落數, 單位為菌落(luo)形成單位(CFU) ;
b ———稀釋倍數;
k ———根據采樣面積、 標準限值單位得出的系數(k =采樣面積
50 , 如采樣面積50 cm2 , 則k =1; 如采
樣面積25 cm2 , 則(ze)k =1/2) 。
若(ruo)有兩個連續稀釋度的平(ping)板菌落數在適宜計數范圍內, 則公(gong)式(shi)(3) 中(zhong)的(de) T ×b 值為 4.6.2 中的
N 值(zhi)。
7.7.2 菌(jun)落數小于(yu)100 CFU 時, 按(an)“四舍五入(ru)”原則修約, 以整數報告。
7.7.3 菌落(luo)數大于或等于100 CFU 時, 第3 位數(shu)字(zi)采用“四舍五入”原則修約(yue)后, 取前2 位數字(zi), 后(hou)面用(yong)0
代替位數: 也可用10 的指數形式來(lai)表示, 按(an)“四舍五(wu)入(ru)”原(yuan)則(ze)修約后, 采用兩(liang)位有(you)效數字。
7.7.4 若真菌(jun)蔓(man)延生長覆(fu)蓋(gai)整(zheng)個平板的可記(ji)錄為菌(jun)落蔓(man)延。
7.7.5 若空(kong)白對照上有菌(jun)落生長, 則此次(ci)檢測結果無效。
7.7.6 如果同(tong)一件(jian)用品采兩(liang)份(fen)樣品, 當兩份樣(yang)品檢測(ce)結(jie)果不一致時, 采(cai)用檢(jian)測值(zhi)高的(de)結(jie)果報告。
7.8 質量控制和生物安全
應符合附錄 B 的(de)要求。
8 β-溶血性鏈球菌
8.1 原理
采(cai)用涂抹法(fa)采(cai)樣(yang), 改(gai)良(liang)胰蛋(dan)白(bai)胨大(da)豆肉湯(tang)增菌, 血瓊脂平板分純培養并使用生化鑒定等方法檢測公
共用品用具中的β-溶血性鏈球菌。
8.2 儀器和耗材
本方(fang)法(fa)中使用(yong)的儀器和耗材(cai)如下:
———高壓(ya)蒸(zheng)汽滅菌器;
———恒溫培養箱:36 ℃ ±1 ℃ ;
———厭氧培(pei)養(yang)裝置;
———冰箱:2 ℃ ~5 ℃ ;
———電(dian)爐或微波爐;
———天平: 感量0.01 g;
———顯微鏡(jing);
———載玻片;
———渦旋混合(he)器;
———微生物生化鑒(jian)定系(xi)統;
———無菌平皿(min): 直徑90 mm;
———無菌刻度吸(xi)管:1 mL(0.01mL 刻度) 、10 mL(0.1 mL 刻度(du)) ;
———微量移液器:1 000 μL;
———無菌錐形瓶: 容(rong)量200 mL、500 mL、1 000 mL、2 000 mL;
———pH 計或精密pH 試(shi)紙(zhi)。
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8.3 培養基和試劑
8.3.1 改良胰蛋白胨大豆肉湯(mTSB)
8.3.1 .1 基礎培養基[胰蛋白胨大(da)豆肉湯(TSB) ]
8.3.1 .1 .1 成分
胰蛋(dan)白胨(dong)17.0 g, 大豆蛋白胨(dong)3.0 g, 氯化(hua)鈉(na)5.0 g, 磷酸二氫(qing)鉀( 無水)2.5 g, 葡萄(tao)糖2.5 g, 純水
1 000 mL。
8.3.1 .1 .2 制法
將8.3.1.1.1 中各成分(fen)溶于純(chun)水中, 加(jia)熱溶解(jie), 校(xiao)正pH 至7.3±0.2,121 ℃ 滅菌15 min, 分裝備用。
8.3.1 .2 抗生素溶液
8.3.1 .2.1 多黏菌素溶液
稱(cheng)取10 mg 多黏菌素 B 于10 mL 滅菌純水中, 振搖(yao)混勻(yun), 充(chong)分(fen)溶(rong)解后過濾除(chu)菌。
8.3.1 .2.2 萘啶酮酸鈉溶液
稱(cheng)取(qu)10 mg 萘啶(ding)酮酸于10 mL0.05 mol/L 氫氧化鈉溶液中, 振搖混勻, 充分(fen)溶解后(hou)過濾除菌。
8.3.1 .3 完全培養基
8.3.1 .3.1 成分
胰蛋白胨大豆肉湯(tang)(TSB) 1 000 mL, 多黏菌(jun)素溶液 10 mL, 萘啶(ding)酮酸鈉溶(rong)液 10 mL。
8.3.1 .3.2 制法
無(wu)菌條件下, 將8.3.1.3.1 中(zhong)各成分進行混合, 充(chong)分混勻, 分裝備用。
8.3.2 哥倫比亞(ya) CNA 血瓊脂
8.3.2.1 成分
胰酪蛋白胨12.0 g, 動物組織(zhi)蛋白(bai)消(xiao)化液5.0 g, 酵母(mu)提(ti)取物3.0 g, 牛肉提取物3.0 g, 玉米淀粉
1.0 g, 氯化鈉5.0 g, 瓊脂13.5 g, 多黏菌素0.01 g, 萘啶酸0.01 g, 純水1 000 mL。
8.3.2.2 制法
將(jiang) 8.3.2.1 中(zhong)各成分溶于純(chun)水中(zhong), 加熱溶解, 校(xiao)正 pH 至 7.3 ±0.2,121 ℃ 滅(mie)菌(jun) 12 min, 待冷卻至
50 ℃ 左右時, 加(jia) 50 mL 無菌脫纖維綿(mian)羊(yang)血, 搖勻后倒平板。
8.3.3 血瓊脂平板
見6.3.3。
8.3.4 革蘭氏染色液
見5.3.4。
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8.3.5 3%過氧化氫(qing)(H2O2 ) 溶液
8.3.5.1 成分
30%過氧(yang)化氫(H2O2 ) 溶(rong)液100 mL, 純水900 mL。
8.3.5.2 制法
吸取(qu)100 mL30%過氧化(hua)氫(H2O2 ) 溶(rong)液, 溶于純水中(zhong), 混勻(yun), 分裝備用(yong)。
8.3.6 生化鑒定試劑盒或生化鑒定卡
商(shang)品化(hua)試劑, 按說明書操作(zuo)。
8.4 檢驗步驟
樣(yang)品檢驗步驟按照以下操作進行。
a) 采樣方法應符(fu)合附錄 A 的要求。
b) 增(zeng)菌: 將放有采樣后棉拭子的(de)生理鹽水試管(guan)在渦(wo)旋混合器上充(chong)分(fen)振搖, 用無菌吸管或微量移液
器吸取液體檢樣1 mL, 接種到9 mL 改(gai)良(liang)胰(yi)蛋(dan)白(bai)胨大豆肉湯中(zhong), 于36 ℃ ±1 ℃ 培養(yang)18 h~
24 h。
c) 分離: 取(qu)1~2 接種環增菌培養物, 劃線接種至哥倫比(bi)亞 CNA 血瓊脂平板,36 ℃ ±1 ℃ 厭氧培
養18 h~24 h, 觀察記(ji)錄(lu)菌落特征(zheng)。 β-溶血性(xing)鏈(lian)球(qiu)菌在(zai)哥倫比亞 CNA 血瓊脂平板上的典型菌
落形態為直徑約2 mm~4 mm, 灰白色、 半透明、 光滑、 表面突(tu)起、 圓形(xing)、 邊(bian)緣整(zheng)齊, 在菌落周圍
形成完全透明的溶血環, 紅細胞完全溶解。
d) 分純(chun)培養: 挑取哥倫比亞CNA 血瓊脂平板上(shang)5 個(如小于5 個則全選) 典型菌落接種血瓊脂平
板,36 ℃ ±1 ℃ 培養18 h~24 h。
e) 革蘭氏(shi)染色鏡(jing)檢: 挑(tiao)取血瓊脂平板上典型菌落(luo)染色鏡檢(jian)。 β-溶血性鏈球菌為革蘭氏染色陽
性, 呈球形或(huo)卵圓形, 常排(pai)列成短鏈狀(zhuang)。
f) 觸酶試驗: 挑取血瓊脂平板上典型菌落于潔凈的載玻片上, 滴(di)加(jia)適量3% 過(guo)氧化氫(qing)溶液, 于半
分鐘內有大量氣泡產生者為陽性, 不(bu)產生氣泡者(zhe)為(wei)陰性(xing),β-溶血(xue)性(xing)鏈(lian)球(qiu)菌觸酶為陰性(xing)。
g) 生化鑒定: 可(ke)使用商(shang)品化生化鑒定試劑(ji)盒或生化鑒定卡對典(dian)型菌落進行鑒定。
8.5 結果報告
綜合(he)以(yi)上(shang)試驗(yan)結(jie)果, 在血瓊脂平(ping)板上(shang)呈(cheng)灰(hui)白(bai)色(se)菌落, 菌落(luo)透(tou)(tou)明或半透(tou)(tou)明, 在菌落周圍形成完全透明
的溶血環, 鏡檢為(wei)革蘭氏染色(se)陽性, 球形或(huo)卵圓(yuan)形, 呈鏈狀排列, 觸酶試驗陰性, 可報告(gao)樣品(pin)中檢出β-溶
血性鏈球菌。 如(ru)果同一件用品用具(ju)采兩份樣品, 當兩份樣(yang)品(pin)檢(jian)測結果不一致(zhi)時(shi), 采用陽性檢測結果
報告。
8.6 質量控制和生物安全
應符合附錄(lu) B 的要(yao)求。
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GB/T 18204.4—2025
附 錄 A
(規范性)
公共場所公共用品用具微生物采樣方法
A.1 概述
本(ben)附錄(lu)規定(ding)了公(gong)共場所公(gong)共用(yong)品用(yong)具微生物(wu)采樣的基本(ben)要(yao)求。
A.2 一般要求
A.2.1 隨機抽取清(qing)洗消毒后(hou)待使用(yong)的公共用(yong)品用(yong)具。
A.2.2 采樣過程(cheng)中應(ying)無菌操作。
A.2.3 采樣步驟: 使(shi)用(yong)滅菌(jun)干燥棉拭子(zi), 于10 mL 滅(mie)菌生理鹽(yan)水(shui)內浸潤(吸取(qu)約1 mL 溶液(ye)) 后, 在用品
用具的適當部位來回均勻涂抹進行樣品采集, 將采集(ji)樣品后(hou)的(de)棉拭子放(fang)入剩余(yu)的(de)9 mL 生理鹽水內(nei), 用
滅菌剪刀剪去棉簽手接觸的部分,4 h 內送檢。
A.3 采集部位與采樣面積
A.3.1 杯具
在杯(bei)具內、 外緣(yuan)與口唇接觸(chu)處, 即(ji)1 cm~2 cm 高處各涂抹(mo)25 cm2 , 內外圈為1 份樣品, 采樣總面積
為50 cm2 。
A.3.2 棉織品
A.3.2.1 將(jiang)毛(mao)巾、 枕(zhen)巾(枕(zhen)套) 、 浴(yu)巾(jin)先對折后展開, 在展開平面上, 取對折(zhe)線兩側(ce)中央對稱位置5 cm×
5 cm (25 cm2 ) 面積范(fan)圍內分(fen)別均(jun)勻涂抹5 次, 每25 cm2 采(cai)樣面積為1 份樣(yang)品, 每件用品(pin)共采集2 份
樣品。
A.3.2.2 在床單、 被(bei)單(被套) 表面與頸部、 腳部接觸部位(wei)5 cm×5 cm(25 cm2 ) 面積范圍內分別均勻涂
抹5 次, 每25 cm2 采(cai)樣(yang)面積為1 份樣(yang)品(pin), 每件(jian)用品共采(cai)集(ji)2 份樣(yang)品。
A.3.2.3 睡衣、 睡褲隨(sui)機選擇 2 處與(yu)皮(pi)膚接觸部位 5 cm ×5 cm(25 cm2 ) 面積范圍內分別均勻 涂
抹5 次(ci), 每25 cm2 采樣面積為1 份樣品, 每件(jian)用(yong)品共采集2 份樣品。
A.3.3 潔具
A.3.3.1 浴盆: 在浴盆內側壁二分之一高(gao)度及盆底中(zhong)央(yang)位置5 cm×5 cm(25 cm2 ) 范圍內分別均勻涂抹
5 次(ci), 每25 cm2 采樣面積為1 份樣品, 每件用品共采(cai)集(ji)2 份樣品。
A.3.3.2 臉(腳) 盆: 在盆內壁二分之一高度, 相對稱的兩側(ce)壁處5 cm×5 cm(25 cm2 ) 范圍內分別均勻
涂抹5 次(ci), 每25 cm2 采樣面積(ji)為1 份樣品, 每件用品共采集(ji)2 份樣品(pin)。
A.3.3.3 坐便器(qi): 在 坐 便(bian) 圈 前 端 彎 曲 處 相 對 稱 的 2 處 5 cm ×5 cm (25 cm2 ) 范 圍 內 分 別 均 勻 涂 抹
5 次, 每25 cm2 采(cai)樣面積(ji)為1 份(fen)樣品, 每(mei)件用(yong)品共(gong)采集(ji)2 份樣品(pin)。
A.3.3.4 按摩(mo)床(椅) : 在(zai)床(椅(yi)) 表面中部選(xuan)擇2 處與人體(ti)接觸(chu)部位5 cm×5 cm(25 cm2 ) 范圍內分別均
勻涂抹5 次 , 每25 cm2 采樣面積為(wei)1 份樣品(pin), 每(mei)件用品共采集(ji)2 份樣品。
A.3.4 鞋類
在每(mei)只(zhi)鞋的鞋內(nei)與(yu)腳(jiao)趾接觸處(chu)5 cm×5 cm(25 cm2 ) 面積范圍內分別均勻涂抹5 次, 每25 cm2 采
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GB/T 18204.4—2025
樣面積為(wei)1 份樣(yang)品, 每雙(shuang)鞋共采(cai)集2 份樣品。
A.3.5 購物車(che)(筐(kuang))
車(筐) 把手: 在 把(ba) 手 1/3 與 2/3 手 易 接(jie) 觸 處(chu) 5 cm ×5 cm (25 cm2 ) 面 積 范 圍 內 分 別 均 勻 涂 抹
5 次, 每25 cm2 采樣面(mian)積為(wei)1 份樣品, 每(mei)件(jian)用品共(gong)采集(ji)2 份(fen)樣品。
A.3.6 美容美發美甲用品
A.3.6.1 理發推子: 在推(tui)子的前部(與皮膚接觸(chu)處) 均勻涂抹(mo)5 次, 采樣面積達到25 cm2 為(wei)1 份樣品(一
把理發推子采樣面積未達到25 cm2 的可加(jia)采其他理(li)發推子(zi)) 。
A.3.6.2 理發刀、 剪: 在刀、 剪兩個面各均勻涂(tu)抹5 次, 采樣面積達到25 cm2 為1 份樣(yang)品(一把理發(fa)刀、
剪的采樣(yang)面積未達(da)到(dao)25 cm2 的(de)可加采其他理發刀、 剪) 。
A.3.6.3 美(mei)容美(mei)甲用品: 在美容(rong)美甲用品表面(與皮(pi)膚接觸處) 均勻涂抹5 次, 采樣面積達(da)到25 cm2 為
1 份樣品(一套美容美甲用品的(de)采樣面積未達到(dao)25 cm2 的可(ke)加(jia)采其他美容美甲用(yong)品(pin)) 。
A.3.7 修腳工具
在修腳工具表面(與皮膚(fu)接觸(chu)處(chu)) 均勻涂抹5 次, 采樣面積(ji)達到25 cm2 為1 份樣品(一套修腳工具

的采樣面(mian)積未達到(dao)25 cm2 的可加(jia)采其他(ta)修腳工具) 。 A.3.8 其他(ta)用品

在用品表面選擇2 處與人體接觸處5 cm×5 cm(25 cm2 ) 面積范圍內分(fen)別采樣(yang), 每25 cm2 采樣面
積為1 份樣品(pin), 每(mei)件用(yong)品共(gong)采(cai)集2 份(fen)樣品。
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附 錄 B
(規(gui)范性)
質量控制和生物安全
B.1 質量控制
B.1 .1 培(pei)養基和試劑需符(fu)合 GB 4789.28 的要求(qiu), 購買國內生產的成品培養基需有中國食品藥品監督
管理局批準的生產文號, 對于(yu)購買(mai)的成品培(pei)養基, 應在培(pei)養基(ji)有效期(qi)內使(shi)用(yong), 嚴格按照培養基要求的貯
存條件進行保存。
B.1 .2 確保所(suo)用試劑(ji)和材料為無菌狀態(tai), 操作過(guo)程中避免人為污染。
B.1 .3 實驗用水的(de)電(dian)導(dao)率在25 ℃ 時不應(ying)超過25 μS/cm( 相當(dang)于電阻率≥0.4 ΜΩ· cm) , 除非另有規
定要求。 水的微生物污染(ran)不應超過103 CFU/mL。
B.2 生物安全
實驗室生物安全(quan)應符合(he) GB19489 的要求, 實驗操(cao)(cao)作人員應掌握(wo)實驗室(shi)生物安(an)全操(cao)(cao)作知識(shi), 在處理
或檢測可疑致病菌時應采取必要的防護措施, 減少職業暴露, 并(bing)保證符(fu)合國家有(you)關(guan)法規(gui)規(gui)定的(de)要求。
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GB/T 18204.4—2025
參 考 文 獻
[1] GB4789.11—2014 食品(pin)(pin)安全國家標準 食品(pin)(pin)微生物學檢驗(yan) β 型溶血性鏈(lian)球菌(jun)檢(jian)