中 華 人 民 共 和(he) 國(guo) 國(guo) 家 標 準
GB 5413.19—2010
中 華 人 民 共 和 國 衛(wei) 生 部(bu) 發布(bu)
2010-03-26 發布 2010-06-01 實(shi)施
食(shi)品安全國家(jia)標準
嬰(ying)幼兒食(shi)品(pin)(pin)和乳品(pin)(pin)中游離生物素(su)的測定
National food safety standard
Determination of free biotin in foods for infants and young children,
milk and milk products

GB 5413.19—2010
I
前 言
本標準代替(ti)GB/T 5413.19-1997《嬰幼兒(er)配方食(shi)品和乳粉 游(you)離生物素的(de)測定》。
本標準附(fu)錄A為規范性附(fu)錄。
本標準所代替(ti)標準的歷次版本發(fa)布情況為：
——GB 5413-1985、 GB/T 5413.19-1997。

GB 5413.19—2010
1
食品安全國家(jia)標(biao)準
嬰(ying)幼兒(er)食品和乳(ru)品中游離(li)生(sheng)物素的(de)測定
1 范圍
本(ben)標準規定(ding)了嬰幼(you)兒食品和乳品中游離生物素的(de)測定(ding)方法。
本標(biao)準適用于嬰幼兒食(shi)品(pin)和乳品(pin)中游(you)離生物(wu)素的測定。
2 規范(fan)性引用文件
本標(biao)準中引(yin)用(yong)(yong)的文(wen)件對于本標(biao)準的應用(yong)(yong)是(shi)必(bi)不可少的。凡是(shi)注(zhu)日期的引(yin)用(yong)(yong)文(wen)件，僅(jin)所注(zhu)日期的版本
適用(yong)于本標(biao)準。凡是不(bu)注日(ri)期的引用(yong)文件，其(qi)最(zui)新版本（包括(kuo)所有(you)的修改單(dan)）適用(yong)于本標(biao)準。
3 原(yuan)理
利用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）對(dui)游離(li)生物素(su)的特異性(xing)和靈敏性(xing)，定(ding)量(liang)測定(ding)出試樣(yang)中待
測(ce)物(wu)(wu)質(zhi)的含(han)量(liang)。在(zai)含(han)有除待測(ce)物(wu)(wu)質(zhi)以外(wai)所有營養(yang)成(cheng)分的培養(yang)基(ji)中，微生物(wu)(wu)的生長與待測(ce)物(wu)(wu)質(zhi)含(han)量(liang)呈(cheng)線性
關(guan)系，根(gen)據(ju)透光(guang)率與標準工(gong)作曲線進(jin)行(xing)比較，即可(ke)計算出試(shi)樣(yang)中待(dai)測物質(zhi)的含(han)量。
4 試劑(ji)和材(cai)料(liao)
除非(fei)另有規(gui)定(ding)，本方(fang)法所用(yong)試劑均為(wei)分析(xi)純，水為(wei) GB/T 6682 規(gui)定(ding)的二級水。
4.1 菌(jun)株：植物乳桿菌(jun)（Lactobacillus plantarum）， ATCC 8014。
4.2 生物(wu)素(su)（d-Biotin 或 Vitamin H）標準品（C10H16N2O3S）：純(chun)度≥99 %。
4.3 培養基
4.3.1 乳酸(suan)桿菌瓊脂培養(yang)基：見附錄 A。
4.3.2 乳酸桿菌肉湯培養基：見(jian)附錄 A。
4.3.3 生物素測定(ding)用培養基：見附(fu)錄 A。
注(zhu)： 一些商品化合成(cheng)培養(yang)基效(xiao)果(guo)良好，商品化合成(cheng)培養(yang)基按標簽說明進行配(pei)制。
4.4 乙(yi)醇溶液（50 %）。
4.5 硫酸溶(rong)液（3 %）：量取 3mL 硫酸加(jia)入到(dao)水中，定容至 100 mL。
4.6 氫氧化(hua)鈉溶液（0.5 mol/L）：稱取 20 g 氫氧化(hua)鈉溶于 1000 mL 水中。
4.7 氯化鈉溶(rong)液（9 g/L）：稱取(qu) 9.0 g 氯化鈉溶(rong)解于 1000 mL 水中，分裝試管(guan)，每管(guan) 10 mL。 121℃ 滅
菌 15 min。
4.8 標準溶液的制備
4.8.1 生(sheng)物(wu)素標準(zhun)貯(zhu)備液（100 μg/mL）：稱取生(sheng)物(wu)素標準(zhun)品（4.2）用乙醇溶(rong)液（4.4）定容至生(sheng)物(wu)素
濃(nong)度為 100 μg/mL，貯于冰(bing)箱(xiang)中。
4.8.2 生(sheng)物素標準(zhun)中(zhong)間液(ye)（1 μg/mL）：吸取 1 mL 生(sheng)物素標準(zhun)貯備液(ye)（4.8.1），用乙醇溶液(ye)（4.4）定
容至 100 mL。
4.8.3 生物素標準工作液（10 ng/mL）：吸取 1 mL 生物素標準中間液（4.8.2），用乙醇溶液（4.4）
定容至 100 mL。
4.8.4 標準曲線工作液

GB 5413.19—2010
2
分兩(liang)個(ge)濃度(du)(du)(du)， 高濃度(du)(du)(du)溶(rong)(rong)液(ye)的(de)濃度(du)(du)(du)為(wei) 0.2 ng/mL； 低(di)濃度(du)(du)(du)溶(rong)(rong)液(ye)的(de)濃度(du)(du)(du)為(wei) 0. 1 ng/mL。 從工作(zuo)液(ye)中(zhong)（4.8.3）
吸(xi)取(qu)兩次各 5 mL，用水分別定容(rong)到 250 mL 和 500 mL。
注：所有(you)標(biao)準(zhun)溶液(ye)要儲存(cun)于冰箱內。 4.8.1、 4.8.2、和(he) 4.8.3 保存(cun)期三(san)個月， 4.8.4 臨用前(qian)配制。
5 儀(yi)器(qi)和設(she)備
除微生物實驗室常規滅菌及培養設(she)備外，其他設(she)備和(he)材(cai)料如下：
5.1 天平：感量為(wei) 0.1 mg。
5.2 pH 計：精度≤0.02。
5.3 分光光度計。
5.4 渦(wo)旋(xuan)混合器。
5.5 離心(xin)機：轉速≥2000 轉/分(fen)鐘(zhong)。
5.6 恒溫培養箱： 36 ℃ ±1 ℃。
5.7 冰箱： 2 ℃～5 ℃。
5.8 無(wu)菌(jun)吸(xi)管： 10 mL (具 0.1 mL 刻度) 或微量移液器或吸頭。
5.9 瓶口分液器： 0 mL～10 mL。
5.10 錐形瓶： 200 mL。
5.11 容量瓶(ping)（A 類）： 100 mL， 250 mL， 500 mL。
5.12 單(dan)刻度(du)移液管（A 類）：容量 5 mL。
5.13 漏(lou)斗：直徑 90 mm。
5.14 定量(liang)濾紙：直徑 90 mm。
5.15 試管： 18mm×180 mm。
注： 玻璃儀器使(shi)用(yong)(yong)前(qian)，用(yong)(yong)活性劑（月桂磺酸鈉(na)或家用(yong)(yong)洗滌劑加(jia)入到洗滌用(yong)(yong)水(shui)中即可）對硬玻璃測定(ding)管及其他(ta)必要(yao)的
玻璃器(qi)皿進行清洗，清洗之后在(zai) 200 ℃ 干(gan)熱 2 h。
6 分析(xi)步驟(zou)
6.1 接種菌(jun)懸液的(de)制備(bei)
6.1.1 將凍干菌(jun)株（4.1）活化后，轉(zhuan)接到乳(ru)酸桿(gan)菌(jun)瓊脂培養基（4.3.1）中， 36 ℃ ±1 ℃培養過(guo)夜。再
轉接 2～3 代來增強活力。然后再將(jiang)其從固體培養上轉接到乳酸桿菌(jun)肉湯培養基（4.3.2）中培養。
6.1.2 將(jiang)乳酸桿菌肉湯(tang)中的培養液(ye)以 2000 轉/分鐘離心(xin) 2 min～3 min，傾出上清液(ye)，加入 10 mL 氯化(hua)
鈉溶液（4.7）， 混勻， 再離心 2 min～3 min， 如此清洗 3 次～4 次， 吸適量(liang)該菌懸液于 10 mL 氯化鈉（4.7）
中，待(dai)測。
6.1.3 用分光光度計以氯化(hua)鈉溶液（4.7）做空白，于 550 nm 波(bo)長下測菌懸液（6.1.2）的透光率，使
其(qi)透光率在 60 %～80 %之間。
6.2 樣品的處理
6.2.1 干粉樣品(pin)
稱取一(yi)定(ding)量樣品（精確至 0.0001 g）于 250 mL 三角瓶中，該樣品應含 0.2 μg～0.5 μg 生物素。繼(ji)續
6.2.3 步驟。
6.2.2 液(ye)體樣品
吸一(yi)定量的液(ye)體樣品于 250 mL 三角瓶中，該樣品應含(han) 0.2 μg～0.5 μg 生物素。繼續(xu) 6.2.3 步驟。
6.2.3 樣品的(de)提取

GB 5413.19—2010
3
加入(ru)硫酸溶液（4.5） 100 mL， 121 ℃ 水解 30 min，冷(leng)卻后用氫氧化鈉溶液（4.6）調(diao)節 pH 至 4.5±0.2，
定量轉到 250 mL 容量瓶(ping)中，用(yong)(yong)水定容，充(chong)分混合。用(yong)(yong)濾(lv)紙過濾(lv)，棄去最初的幾毫升。吸取濾(lv)液 5 mL，
加(jia)入約 20 mL 水，用氫氧化鈉溶液（4.6）調 pH 為 6.8±0.2,定量(liang)轉(zhuan)到 100 mL 容(rong)量(liang)瓶中，用水定容(rong)。
6.3 標準曲(qu)線的制作
按表 1 順序加(jia)入(ru)水、標準曲(qu)線(xian)工作液(ye)（4.8.4）和生物(wu)素測定(ding)用培(pei)(pei)養(yang)基（4.3.3）于培(pei)(pei)養(yang)管中(zhong)，一式三
份。
表1 標準曲線的(de)制作

6.4 待(dai)測(ce)液的(de)制作
按表(biao) 2 順序加水(shui)、樣品溶液（6.2.3）和生物素(su)測定用培(pei)養基（4.3.3）于培(pei)養管內，一式三份。
每份樣品需帶樣品空白試(shi)管一只(zhi)，管內分別加入5 mL待測液(ye)和5 mL培養基。
表(biao)2 待測液的制作

6.5 滅菌
將6.3和6.4中所有的試管(guan)蓋上試管(guan)帽(mao)，放(fang)入滅(mie)菌(jun)釜內，  121 ℃ 滅(mie)菌(jun)5 min（商(shang)品培(pei)養基(ji)按標簽說明進
行滅(mie)菌）。
6.6 接(jie)種(zhong)
從滅菌(jun)釜內取出(chu)試管(guan)(guan)，將試管(guan)(guan)迅速(su)冷卻至30 ℃ 以下。將接種菌(jun)懸(xuan)液（6.1.2）用滴管(guan)(guan)或移液器向上(shang)
述試管中各滴(di)加一(yi)滴(di)（約50 μL），其中標(biao)準曲線管中未接種(zhong)空(kong)白(bai)S1和樣品空(kong)白(bai)除(chu)外。
6.7 培養
將試管(guan)放入培養(yang)箱內， 36 ℃ ±1 ℃ 培養(yang)19 h～20 h。
6.8 測定
對每支試管進行視覺(jue)檢查，接種空白試管 S1 內培(pei)養液應是澄清的(de)，如果出現渾(hun)濁，則(ze)結果無效。
6.8.1 以接種空(kong)白試管 S1 做對照，測(ce)(ce)定(ding)最高濃度(du)標準(zhun)曲線(xian)試管的吸光度(du)，兩小時后重新測(ce)(ce)定(ding)。兩次(ci)
結果(guo)透光(guang)(guang)率差(cha)值(zhi)若小于 2 %，則(ze)取出全部檢驗(yan)管測其吸光(guang)(guang)度 A。
6.8.2 以接種(zhong)空白(bai)試(shi)管(guan) S2 為(wei)空白(bai)，調(diao)節吸(xi)光度為(wei) 0，依次讀出其他(ta)每支試(shi)管(guan)的吸(xi)光度 A，樣(yang)品空白(bai)的
吸光度 A 一并讀出。
6.8.3 用渦旋混(hun)合(he)器充分混(hun)合(he)每一支試管(guan)（也可以加一滴(di)消(xiao)泡劑(ji)）后，立即將培(pei)養液移入(ru)比色皿(min)內進
行測定(ding)(ding)，波(bo)長為 550 nm，待(dai)讀(du)(du)數穩定(ding)(ding) 30 s 后，讀(du)(du)出吸(xi)光度 A，每支試(shi)管(guan)穩定(ding)(ding)時(shi)間要相同(tong)。以生物素標
準品的(de)含(han)量(liang)為橫坐(zuo)標，吸(xi)光度 A 為縱坐(zuo)標作(zuo)標準曲線。
6.8.4 待(dai)測液培養試(shi)管(guan)中，樣(yang)品空白(bai)試(shi)管(guan)吸光(guang)度應(ying)小于(yu) 0.05。若樣(yang)品空白(bai)試(shi)管(guan)吸光(guang)度大(da)于(yu) 0.02，加入
待(dai)測(ce)液(ye) 1 mL 的(de)試(shi)管(guan)的(de)吸光(guang)度值(zhi)要減(jian)去其樣品空白試(shi)管(guan)吸光(guang)度值(zhi)的(de) 1/5， 加(jia)入待(dai)測(ce)液(ye) 2 mL 的(de)試(shi)管(guan)的(de)吸光(guang)

GB 5413.19—2010
4
度值(zhi)要減(jian)去其樣品空白試(shi)管(guan)吸光度值(zhi)的(de) 2/5，以(yi)此類推(tui)，作為計算(suan)結果的(de)依據。根據待測液(ye)的(de)吸光度 A，
從(cong)標準曲線(xian)中查得該待測(ce)液中生(sheng)物素的濃度，再(zai)根據(ju)稀(xi)釋因子(zi)和稱樣(yang)量計算出試樣(yang)中生(sheng)物素的含量。吸
光度值超出標(biao)準曲線管 S3～S10 范圍的(de)試樣管要舍(she)去。
6.8.5 對每(mei)個編(bian)號的(de)待測(ce)液試管(guan)，用每(mei)支試管(guan)的(de)吸光度值(zhi)計(ji)算每(mei)毫升該編(bian)號待測(ce)液生物素的(de)含量(liang)，并
計算該(gai)編號待(dai)測(ce)液(ye)的(de)生(sheng)物素含量(liang)平均(jun)(jun)值，每支試(shi)管(guan)測(ce)得(de)(de)的(de)該(gai)濃度不(bu)得(de)(de)超過該(gai)平均(jun)(jun)值的(de)±15%，超過者要
舍(she)去。如(ru)果符合該(gai)要求的(de)管數(shu)少(shao)于所有四個(ge)編(bian)號(hao)待測液(ye)總(zong)管數(shu)的(de) 2/3，需(xu)要重新檢驗。如(ru)果符合該(gai)要求
的管數大(da)于等于原來管數的 2/3， 重新計算每一(yi)編號的有效試樣管中每毫(hao)升測(ce)定(ding)液生(sheng)物素含量的平均(jun)值(zhi)，
以此平均(jun)值(zhi)計算全(quan)部編號試樣管的總平均(jun)值(zhi) Cx，用于計算(suan)試樣中的生物素含量。
7 分析結果的表述
試樣中生物素(su)的(de)含量按公式(shi) (1) 計算：
100
1000
= × ×
f
Cm
X x ……………………………………………(1)
式中：
X——試樣中生物素的(de)含量，單位為微克(ke)每百克(ke)（μg/100 g）；
Cx——6.8.5 中計算(suan)所得的總平均值，單位為納克（ng）；
m——試樣的質(zhi)量，單位(wei)為克（g）；
f ——稀釋倍數。
以重復(fu)性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術(shu)平(ping)均值表(biao)示，結果保留兩位有效數字(zi)。
8 精密度(du)
在(zai)重(zhong)復性條件下(xia)獲(huo)得(de)的兩次(ci)獨立測定(ding)結(jie)果的絕(jue)對差值不得(de)超過算術平(ping)均值的 10 %。
9 其他
本標(biao)準檢出限為 20.0 μg/kg。

GB 5413.19—2010
5
附(fu)錄 A
（規范性附錄(lu)）
培養基和試劑
A.1 乳酸桿菌瓊脂培養基
A.1.1 成分
胨化(hua)乳 15.0 g，酵(jiao)母(mu)浸膏 5.0 g，葡萄(tao)糖 10.0 g，番茄汁 100 mL，磷酸二氫鉀(jia) 2.0 g，聚(ju)山梨糖單油
酸酯(zhi) 1.0 g，加水至 1000 mL，調節(jie) pH 至 6.8±0.2（25 ±5 ℃ ℃ ）。
A.1.2 制法
在(zai) A.1.1 中(zhong)加(jia)入 10.0 g 瓊脂，加(jia)熱煮沸，使瓊脂溶化(hua)。混合均勻后(hou)分裝試管，每管 10 mL。 121 ℃
高壓滅(mie)菌 15 min，備(bei)用(yong)。
A.2 乳酸桿菌肉湯培養(yang)基(ji)
A.2.1 成分
胨化乳 15.0 g，酵母浸膏 5.0 g，葡萄糖 10.0 g，番(fan)茄(qie)汁 100 mL，磷酸二氫鉀 2.0 g，聚山(shan)梨糖單油
酸酯 1.0 g，加水至(zhi)(zhi) 1000 mL，調節 pH 至(zhi)(zhi) 6.8 ±0.2（25 ℃ ±5 ℃ ）。
A.2.2 制法
將 A.2.1 成分(fen)(fen)加熱煮沸，混(hun)合均勻后分(fen)(fen)裝(zhuang)試管，每管 10 mL。 121 ℃ 高壓滅菌 15 min。
A.3 生物素測定(ding)用(yong)培養基
A.3.1 成(cheng)分(fen)
維生素測定用酪蛋白(bai)氨基(ji)酸(suan) 12.0 g，葡萄(tao)糖 40.0 g，乙酸(suan)鈉 20.0 g， L-胱氨酸(suan) 0.2 g， DL-色氨酸(suan) 0.2
g，硫(liu)酸(suan)腺嘌呤(ling) 20.0 mg，鹽酸(suan)鳥嘌呤(ling) 20.0 mg，尿嘧啶 20.0 mg，鹽酸(suan)硫(liu)胺素 2.0 mg，核(he)黃素 2.0 mg，
煙酸(suan) 2.0 mg，泛酸(suan)鈣 2.0 mg，鹽酸(suan)吡(bi)哆(duo)醇 4.0 mg， p-氨基苯甲酸(suan) 200.0 μg，磷酸(suan)氫二鉀 1.0 g，磷酸(suan)二
氫鉀 1.0 g，硫酸(suan)鎂 0.4 g，氯化鈉 20.0 mg，硫酸(suan)亞鐵(tie) 20.0 mg，硫酸(suan)錳 20.0 mg，加水至 1000 mL，pH 6.8±0.2
（25 ℃ ±5 ℃ ）。
A.3.2 制法(fa)
將上述(shu)成分(fen)溶解(jie)于水中，調節 pH，備(bei)用

 中 華 人 民 共 和(he) 國 國 家 標(biao) 準
GB 5413.19—2010
中 華 人 民 共(gong) 和 國 衛 生 部 發(fa)布
2010-03-26 發布 2010-06-01 實施
食品安全國家標準
嬰幼兒食品和乳品中游(you)離(li)生(sheng)物素的測定
National food safety standard
Determination of free biotin in foods for infants and young children,
milk and milk products

GB 5413.19—2010
I
前 言
本標準代替GB/T 5413.19-1997《嬰(ying)幼兒配(pei)方食品和乳粉(fen) 游離生物(wu)素的測(ce)定》。
本標準附(fu)錄A為規范性附(fu)錄。
本標準所代(dai)替標準的歷次版(ban)本發布情(qing)況為：
——GB 5413-1985、 GB/T 5413.19-1997。

GB 5413.19—2010
1
食品安全國家標準(zhun)
嬰幼兒食品(pin)(pin)和乳品(pin)(pin)中(zhong)游(you)離生物(wu)素的測定
1 范(fan)圍
本標準規(gui)定了嬰幼兒食品和乳(ru)品中(zhong)游(you)離生物(wu)素(su)的(de)測定方法。
本標準適用于嬰(ying)幼兒食品和乳品中游離生物素的測定。
2 規范性引用文(wen)件
本(ben)標(biao)準中引用的(de)文件對(dui)于(yu)本(ben)標(biao)準的(de)應用是必不可少的(de)。凡是注(zhu)(zhu)日(ri)(ri)期的(de)引用文件，僅所注(zhu)(zhu)日(ri)(ri)期的(de)版本(ben)
適用于(yu)本(ben)標準(zhun)。凡是不注日期的(de)引用文(wen)件，其最新版本(ben)（包括所有的(de)修改(gai)單）適用于(yu)本(ben)標準(zhun)。
3 原理
利用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）對游離生(sheng)物素的特(te)異性和靈敏性，定量測定出試樣中待
測物質(zhi)的含(han)(han)量。在含(han)(han)有除待測物質(zhi)以外所有營(ying)養成分的培養基中，微生物的生長與待測物質(zhi)含(han)(han)量呈(cheng)線性
關系，根據透光率與標準工作曲線進行比較，即可(ke)計算出(chu)試樣中待測(ce)物(wu)質的含量(liang)。
4 試劑和材料
除非另(ling)有規(gui)定，本方法所用試劑均為分析純(chun)，水為 GB/T 6682 規(gui)定的二(er)級水。
4.1 菌株：植物(wu)乳(ru)桿菌（Lactobacillus plantarum）， ATCC 8014。
4.2 生物素（d-Biotin 或 Vitamin H）標準品(pin)（C10H16N2O3S）：純度(du)≥99 %。
4.3 培養(yang)基(ji)
4.3.1 乳(ru)酸(suan)桿菌瓊脂培養基：見附錄(lu) A。
4.3.2 乳酸桿(gan)菌肉(rou)湯培養基：見附錄 A。
4.3.3 生(sheng)物(wu)素測(ce)定用培養(yang)基：見附錄 A。
注： 一(yi)些商(shang)(shang)品(pin)(pin)化(hua)合(he)成培養(yang)基(ji)效果良好，商(shang)(shang)品(pin)(pin)化(hua)合(he)成培養(yang)基(ji)按標簽說明(ming)進行配制。
4.4 乙醇溶液（50 %）。
4.5 硫酸(suan)溶液（3 %）：量(liang)取 3mL 硫酸(suan)加入到水中(zhong)，定容至 100 mL。
4.6 氫氧化(hua)鈉溶液（0.5 mol/L）：稱取(qu) 20 g 氫氧化(hua)鈉溶于(yu) 1000 mL 水中。
4.7 氯化(hua)鈉溶(rong)液（9 g/L）：稱(cheng)取 9.0 g 氯化(hua)鈉溶(rong)解于 1000 mL 水中，分(fen)裝試管，每管 10 mL。 121℃ 滅
菌 15 min。
4.8 標準溶液的制備
4.8.1 生物(wu)素(su)標(biao)(biao)準貯備液（100 μg/mL）：稱取生物(wu)素(su)標(biao)(biao)準品（4.2）用乙(yi)醇溶(rong)液（4.4）定容至生物(wu)素(su)
濃度為 100 μg/mL，貯于冰箱中。
4.8.2 生物素標準(zhun)中間液(ye)（1 μg/mL）：吸取 1 mL 生物素標準(zhun)貯備液(ye)（4.8.1），用乙醇溶(rong)液(ye)（4.4）定
容至 100 mL。
4.8.3 生物(wu)素(su)標(biao)準工作(zuo)液(ye)（10 ng/mL）：吸取 1 mL 生物(wu)素(su)標(biao)準中間液(ye)（4.8.2），用(yong)乙醇溶液(ye)（4.4）
定容至 100 mL。
4.8.4 標準曲(qu)線工作液

GB 5413.19—2010
2
分兩(liang)個濃度(du)， 高濃度(du)溶(rong)液的濃度(du)為 0.2 ng/mL； 低濃度(du)溶(rong)液的濃度(du)為 0. 1 ng/mL。 從工作液中（4.8.3）
吸(xi)取兩次各 5 mL，用水分別定容到 250 mL 和 500 mL。
注(zhu)：所有(you)標(biao)準溶液要儲存(cun)于冰(bing)箱內。 4.8.1、 4.8.2、和 4.8.3 保存(cun)期三個月， 4.8.4 臨用前配制。
5 儀(yi)器和(he)設(she)備(bei)
除微生物實(shi)驗室常規滅(mie)菌及培養設備外(wai)，其他設備和材料如下：
5.1 天平：感量(liang)為(wei) 0.1 mg。
5.2 pH 計：精度≤0.02。
5.3 分(fen)光光度計。
5.4 渦旋(xuan)混(hun)合器。
5.5 離(li)心(xin)機：轉速≥2000 轉(zhuan)/分(fen)鐘。
5.6 恒溫培養箱： 36 ℃ ±1 ℃。
5.7 冰(bing)箱： 2 ℃～5 ℃。
5.8 無(wu)菌吸管： 10 mL (具 0.1 mL 刻度) 或微量移液器或吸頭(tou)。
5.9 瓶(ping)口分液器： 0 mL～10 mL。
5.10 錐(zhui)形瓶(ping)： 200 mL。
5.11 容量瓶（A 類）： 100 mL， 250 mL， 500 mL。
5.12 單刻度移(yi)液管（A 類）：容量(liang) 5 mL。
5.13 漏斗：直徑 90 mm。
5.14 定(ding)量濾(lv)紙：直(zhi)徑 90 mm。
5.15 試管： 18mm×180 mm。
注(zhu)： 玻璃儀(yi)器使用(yong)前，用(yong)活性劑(ji)（月桂磺酸(suan)鈉或家用(yong)洗滌劑(ji)加(jia)入到洗滌用(yong)水中(zhong)即可）對(dui)硬玻璃測定管及其他(ta)必要(yao)的
玻璃器皿進行(xing)清洗，清洗之后在 200 ℃ 干(gan)熱 2 h。
6 分(fen)析步驟
6.1 接種菌懸液(ye)的制備(bei)
6.1.1 將凍(dong)干菌株（4.1）活化(hua)后，轉接到乳酸桿菌瓊脂培養基（4.3.1）中， 36 ℃ ±1 ℃培養過(guo)夜。再
轉接 2～3 代(dai)來增強活(huo)力。然后(hou)再將其從固(gu)體培養上轉接到乳酸桿菌肉湯培養基（4.3.2）中培養。
6.1.2 將乳酸(suan)桿菌肉(rou)湯(tang)中的培養液以 2000 轉(zhuan)/分鐘離心 2 min～3 min，傾(qing)出上(shang)清液，加(jia)入 10 mL 氯化(hua)
鈉溶(rong)液（4.7）， 混勻(yun)， 再離心 2 min～3 min， 如此清洗 3 次～4 次， 吸適量該菌懸液于 10 mL 氯化(hua)鈉（4.7）
中，待測。
6.1.3 用分(fen)光(guang)光(guang)度計以(yi)氯化鈉(na)溶(rong)液（4.7）做空白，于 550 nm 波長(chang)下測菌懸液（6.1.2）的(de)透(tou)光(guang)率，使
其透光率在 60 %～80 %之(zhi)間。
6.2 樣品的(de)處理
6.2.1 干粉樣品
稱取一定(ding)量樣(yang)品(pin)（精確至 0.0001 g）于 250 mL 三角瓶中，該(gai)樣(yang)品(pin)應含 0.2 μg～0.5 μg 生物(wu)素。繼續(xu)
6.2.3 步驟。
6.2.2 液體樣(yang)品
吸一定(ding)量的(de)液體樣品于 250 mL 三角瓶中，該樣品應含 0.2 μg～0.5 μg 生物素。繼續 6.2.3 步(bu)驟。
6.2.3 樣品(pin)的提取(qu)

GB 5413.19—2010
3
加入(ru)硫酸溶液（4.5） 100 mL， 121 ℃ 水解(jie) 30 min，冷卻后用氫(qing)氧化(hua)鈉溶液（4.6）調(diao)節 pH 至 4.5±0.2，
定量轉到 250 mL 容(rong)量瓶中，用水定容(rong)，充(chong)分(fen)混合(he)。用濾(lv)紙過濾(lv)，棄去最初的幾(ji)毫升(sheng)。吸取濾(lv)液 5 mL，
加(jia)入約 20 mL 水，用氫氧(yang)化鈉(na)溶液（4.6）調 pH 為 6.8±0.2,定量(liang)轉到 100 mL 容(rong)量(liang)瓶中，用水定容(rong)。
6.3 標(biao)準曲線的制(zhi)作
按表 1 順序加入水、標準曲線工作液(ye)（4.8.4）和生(sheng)物素測定用培養(yang)基（4.3.3）于培養(yang)管中，一(yi)式(shi)三
份。
表1 標準(zhun)曲線的(de)制作

6.4 待(dai)測液的制(zhi)作
按表 2 順序加水、樣品(pin)溶(rong)液（6.2.3）和(he)生(sheng)物素測定(ding)用培養基（4.3.3）于培養管內，一式三份。
每份樣品需帶樣品空白(bai)試管一只，管內分別(bie)加入5 mL待(dai)測液和(he)5 mL培養(yang)基(ji)。
表2 待測液(ye)的制(zhi)作

6.5 滅菌
將6.3和6.4中所有的試管蓋上(shang)試管帽(mao)，放(fang)入滅菌釜(fu)內， 121 ℃ 滅菌5 min（商品培(pei)養基(ji)按標簽說明進
行滅菌）。
6.6 接(jie)種
從滅菌釜內取出試(shi)管，將(jiang)試(shi)管迅速冷卻至30 ℃ 以下(xia)。將(jiang)接(jie)種菌懸液（6.1.2）用滴管或移液器向上(shang)
述試管中(zhong)各滴(di)加一滴(di)（約(yue)50 μL），其中(zhong)標準(zhun)曲(qu)線管中(zhong)未(wei)接種空白S1和樣品(pin)空白除外。
6.7 培養
將試管放入培養(yang)箱內， 36 ℃ ±1 ℃ 培養(yang)19 h～20 h。
6.8 測定(ding)
對每支試管進行(xing)視覺檢(jian)查(cha)，接種空白試管 S1 內培養液應是(shi)澄清的，如果出現渾濁，則(ze)結(jie)果無(wu)效。
6.8.1 以接種空白試(shi)管 S1 做對照，測定最高(gao)濃度標準曲線試(shi)管的吸光度，兩小(xiao)時(shi)后(hou)重新測定。兩次(ci)
結果透光率差值若小于 2 %，則取出全部檢(jian)驗管測其吸光度 A。
6.8.2 以接(jie)種空(kong)白(bai)試(shi)管(guan) S2 為空(kong)白(bai)，調節吸(xi)光度(du)為 0，依(yi)次讀(du)出其他每支(zhi)試(shi)管(guan)的吸(xi)光度(du) A，樣品空(kong)白(bai)的
吸光度 A 一(yi)并(bing)讀出。
6.8.3 用渦旋混合器充(chong)分混合每一(yi)支試(shi)管（也可(ke)以加一(yi)滴(di)消泡劑）后，立即將培養液(ye)移入比色皿內進
行測(ce)定，波長為 550 nm，待讀(du)數穩定 30 s 后(hou)，讀(du)出(chu)吸光度(du) A，每支試管穩定時間要相同(tong)。以生物素(su)標
準品的含(han)量為橫坐標(biao)，吸光度 A 為縱坐標(biao)作標(biao)準曲線(xian)。
6.8.4 待測液培養試(shi)管(guan)中，樣(yang)品空(kong)白試(shi)管(guan)吸光度應小于 0.05。若樣(yang)品空(kong)白試(shi)管(guan)吸光度大于 0.02，加入
待(dai)測(ce)液 1 mL 的(de)試(shi)(shi)管的(de)吸光(guang)度(du)值(zhi)要(yao)減去其樣品空白試(shi)(shi)管吸光(guang)度(du)值(zhi)的(de) 1/5， 加入(ru)待(dai)測(ce)液 2 mL 的(de)試(shi)(shi)管的(de)吸光(guang)

GB 5413.19—2010
4
度(du)(du)值(zhi)(zhi)要(yao)減去其樣品空白試管吸光度(du)(du)值(zhi)(zhi)的(de) 2/5，以此類推，作為計算結(jie)果的(de)依據。根(gen)據待測液(ye)的(de)吸光度(du)(du) A，
從標準曲線中(zhong)查得該(gai)待測液中(zhong)生物素的濃(nong)度，再根據稀釋因子和稱樣量計算(suan)出試樣中(zhong)生物素的含量。吸
光度值超出標準曲線管 S3～S10 范圍的試樣(yang)管要舍(she)去。
6.8.5 對每(mei)個編號的待測液試管，用每(mei)支試管的吸光度值計算每(mei)毫升該編號待測液生(sheng)物(wu)素(su)的含量(liang)，并
計算(suan)該編號待測液的(de)生物素含量平(ping)均(jun)值，每支試管(guan)測得的(de)該濃度不得超過該平(ping)均(jun)值的(de)±15%，超過者要
舍去。如果符合該要求的(de)管(guan)數(shu)(shu)少(shao)于所有四個(ge)編號(hao)待測液總管(guan)數(shu)(shu)的(de) 2/3，需(xu)要重新檢驗(yan)。如果符合該要求
的管數(shu)大(da)于(yu)等(deng)于(yu)原來管數(shu)的 2/3， 重新(xin)計算每一編號的有效試(shi)樣(yang)管中(zhong)每毫(hao)升測定液生物素含量的平均值，
以(yi)此平均值計算(suan)全(quan)部(bu)編號試樣管的總平均值 Cx，用于計(ji)算試樣中的生物(wu)素含(han)量。
7 分析結果(guo)的表述
試樣中生物素的含(han)量(liang)按公式 (1) 計(ji)算：
100
1000
= × ×
f
Cm
X x ……………………………………………(1)
式(shi)中(zhong)：
X——試樣中生(sheng)物素的含量(liang)，單位為微(wei)克每(mei)百克（μg/100 g）；
Cx——6.8.5 中計算所(suo)得的(de)總平均值，單位為納克（ng）；
m——試樣(yang)的質量，單位為克(ke)（g）；
f ——稀釋倍數。
以重(zhong)復性條件下(xia)獲得的兩次獨立測定結果(guo)的算術平(ping)均值表示(shi)，結果(guo)保(bao)留兩位有效數字。
8 精密度
在(zai)重復(fu)性條件下獲得的(de)兩次獨(du)立測定結果的(de)絕對差值(zhi)不得超過算術(shu)平均值(zhi)的(de) 10 %。
9 其他
本標準(zhun)檢出(chu)限為 20.0 μg/kg。

GB 5413.19—2010
5
附錄 A
（規范性附錄(lu)）
培養基和試劑
A.1 乳酸桿(gan)菌(jun)瓊(qiong)脂(zhi)培養(yang)基(ji)
A.1.1 成分
胨化乳 15.0 g，酵母浸膏 5.0 g，葡(pu)萄糖 10.0 g，番(fan)茄汁 100 mL，磷酸二氫(qing)鉀(jia) 2.0 g，聚山梨(li)糖單油
酸酯 1.0 g，加水(shui)至(zhi) 1000 mL，調(diao)節 pH 至(zhi) 6.8±0.2（25 ±5 ℃ ℃ ）。
A.1.2 制(zhi)法
在 A.1.1 中加入(ru) 10.0 g 瓊脂(zhi)，加熱(re)煮(zhu)沸，使瓊脂(zhi)溶化。混合均勻后分裝試管，每管 10 mL。 121 ℃
高壓滅菌 15 min，備用(yong)。
A.2 乳酸(suan)桿菌肉湯培(pei)養基
A.2.1 成(cheng)分(fen)
胨化乳 15.0 g，酵母浸(jin)膏 5.0 g，葡(pu)萄糖 10.0 g，番(fan)茄汁 100 mL，磷酸二氫鉀 2.0 g，聚山梨糖單油
酸(suan)酯(zhi) 1.0 g，加水至(zhi) 1000 mL，調節 pH 至(zhi) 6.8 ±0.2（25 ℃ ±5 ℃ ）。
A.2.2 制法
將 A.2.1 成分加熱煮沸，混合均勻后分裝試管，每管 10 mL。 121 ℃ 高(gao)壓滅(mie)菌 15 min。
A.3 生物素測(ce)定用培養(yang)基
A.3.1 成分
維生素測(ce)定用(yong)酪蛋白(bai)氨基酸 12.0 g，葡萄糖(tang) 40.0 g，乙酸鈉 20.0 g， L-胱氨酸 0.2 g， DL-色(se)氨酸 0.2
g，硫(liu)酸(suan)腺嘌呤 20.0 mg，鹽酸(suan)鳥嘌呤 20.0 mg，尿(niao)嘧啶(ding) 20.0 mg，鹽酸(suan)硫(liu)胺(an)素(su) 2.0 mg，核(he)黃(huang)素(su) 2.0 mg，
煙酸(suan)(suan) 2.0 mg，泛酸(suan)(suan)鈣 2.0 mg，鹽(yan)酸(suan)(suan)吡(bi)哆(duo)醇 4.0 mg， p-氨基苯甲(jia)酸(suan)(suan) 200.0 μg，磷酸(suan)(suan)氫二鉀 1.0 g，磷酸(suan)(suan)二
氫鉀 1.0 g，硫酸(suan)鎂 0.4 g，氯化鈉 20.0 mg，硫酸(suan)亞鐵 20.0 mg，硫酸(suan)錳 20.0 mg，加水至 1000 mL，pH 6.8±0.2
（25 ℃ ±5 ℃ ）。
A.3.2 制法
將上述成分溶(rong)解于水中，調節 pH，備用