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GB/T 4789

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GB/T 4789.30-2025 食品安全國家標準食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗

[所屬分類:GB/T 4789] [發布時間:2019-8-9] [發布人:wwxa] [閱讀次數:] [返回]

中華人民共和國國家標準
GB 4789.30—2025
食品安全國家標準
食品微生物學檢驗
單核細胞增生李斯特氏菌檢驗
2025-03-16 發布 2025-09-16 實施
中華人民共和國國家衛生健康委員會
國家市場監督管理總局發布
前言

本標(biao)準代替 GB4789.30—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗
菌檢驗》。

單核細(xi)胞增生李斯特氏

菌種	木(mu)糖	鼠李糖	葡萄糖	麥芽(ya)糖	甘露醇	七葉苷	MR-VP	溶血試驗
單核細胞增生李斯特氏菌 (L .monocytogenes )	-	+	+	+	-	+	+/+	+
格氏李斯特氏菌 (L .grayi )	-	-	+	+	+	+	+/+	-
斯氏李斯特氏菌 (L s. eeligeri )	+	-	+	+	-	+	+/+	+
威氏李斯特氏菌 (L .welshimeri )	+	V	+	+	-	+	+/+	-
伊氏李斯特氏菌 (L i. vanovii )	+	-	+	+	-	+	+/+	+
英諾克李斯特氏菌 (L i. nnocua )	-	V	+	+	-	+	+/+	-
部分(fen)單核細胞增生李斯特氏菌不溶血。個別單(dan)核細胞增生李斯特氏菌血清型不能(neng)發(fa)酵鼠李糖
注: - 表示90% ~100% 的菌株陰性(xing); + 表示90% ~100% 的(de)菌(jun)株陽性; V 表示反應不定。

如選(xuan)擇生化鑒定(ding)試(shi)劑盒或微(wei)生物生化鑒定(ding)系統, 可不經5.4 初步鑒(jian)定, 直接從 TSA-YE 平板或羊血
平板上挑取可疑菌落, 用(yong)生(sheng)理鹽水制備成(cheng)濁度適當的(de)菌懸液, 使用微生物生化鑒定試劑盒或微生物生化
鑒定系統進行鑒定。
5.6 小鼠毒力試驗(可選項目)
將符合上述特性的純培養物接種于 TSB-YE 中, 于36 ℃ ±1 ℃ 培養24 h,4000r/min 離心(xin)5 min,
棄上清液(ye), 用(yong)無菌生理鹽水(shui)制(zhi)備成濃(nong)度為(wei)1010 CFU/mL 的菌(jun)懸液, 取此菌懸液對(dui)3 只(zhi)~5 只小鼠進行
腹腔注射, 每只0.5 mL, 同時觀察小鼠死亡情況。小(xiao)鼠于2 d~5 d 內死亡者為致病株。試驗設單核細
胞增生李斯特氏菌致病株和無菌生理鹽水對照組。單核細胞增生李(li)斯(si)特(te)氏菌、伊氏李斯特氏菌對小鼠
有致病性。
6 結果與報告
綜合5.4、5.5 鑒定結果, 報告(gao)25 g(mL) 樣品中(zhong)檢出(chu)或未檢出(chu)單核細胞增生(sheng)李斯特(te)氏菌。 25 g(mL)
樣(yang)品(pin)中未(wei)檢出單核細(xi)胞增生李(li)斯特氏菌也可(ke)報(bao)告為0/25 g(mL) 。
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GB 4789.30—2025
第二法單核細胞增生李斯特氏菌平板計數法
7 檢驗程序
單(dan)核細胞增(zeng)生李(li)斯(si)特(te)氏菌平板計數程序(xu)見(jian)圖2。
圖2 單核細胞增生李斯特氏菌平板計數程序
8 操作步驟
8.1 樣品的稀釋
8.1 .1 以無菌(jun)操作取25 g(mL) 樣(yang)品, 置于盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或無添加劑的Fraser 增菌肉湯的
無菌均質杯內,8 000r/min~10 000r/min 均質1 min~2 min, 或放入(ru)盛有225 mL 上述稀釋液的無菌
均質袋中, 用(yong)拍(pai)(pai)擊式均(jun)質器拍(pai)(pai)打1 min~2 min, 制(zhi)成(cheng)1∶ 10 的樣品勻液。若樣品為液態(tai), 也可采用振蕩
或攪拌混勻, 制成1∶ 10 的樣品(pin)勻液。
8.1 .2 用1 mL 無菌吸管或(huo)移液(ye)器(qi)吸取1∶ 10 樣(yang)品勻液(ye)1 mL, 沿管壁緩慢注于盛(sheng)有(you)9 mL 磷酸鹽緩沖
液或無添加劑的 Fraser 增菌(jun)肉湯的無菌(jun)試管中(注意吸管或吸頭尖端(duan)不要觸及稀釋液面) , 充分混勻,
制成1∶ 100 的樣品勻液。
8.1 .3 按(an)8.1.2 操作程序(xu), 制(zhi)備10 倍系列稀釋樣品勻液。每(mei)遞增(zeng)稀釋1 次, 換用1 支(zhi)1 mL 無菌吸管或
吸頭。
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GB 4789.30—2025
8.2 樣品的接種
8.2.1 根據(ju)對樣品污染(ran)狀況的估計, 選(xuan)擇(ze)2 個(ge)~3 個適宜連續稀(xi)釋度(du)的樣品勻液( 液體樣品可包括原
液) , 每(mei)個(ge)稀釋度(du)分別吸取(qu)0.1mL 樣(yang)品(pin)勻液, 接(jie)種(zhong)1 個 OA 李斯特氏菌顯色(se)培(pei)養基( 或其他等效的李斯
特氏菌顯色培養基) 平板。并用無(wu)菌(jun)涂布棒涂布整個(ge)平板, 注(zhu)意不(bu)要觸及平板邊緣。使用前, 如瓊脂平
板表面有水珠, 可放在(zai)25 ℃ ~50 ℃ 的培養箱里(li)干燥, 直到(dao)平板表面的水珠消失。
注: 必要時, 每個稀釋度可做重復試驗。
8.2.2 對于(yu) 單核細胞(bao) 增生李斯(si) 特(te) 氏(shi) 菌含量較低的食品(pin) 樣品(pin), 吸取 1mL 最低(di) 稀釋度樣(yang) 品(pin) 勻(yun) 液, 以
0.3 mL、 0.3 mL、0.4 mL 的接(jie)種量分(fen)別涂布(bu)于3 塊(kuai) OA 李(li)斯特氏菌顯(xian)色培養(yang)基(或其他等效的李斯特
氏菌顯色培養基) 平板。涂布方法同(tong)8.2.1。
8.2.3 從樣(yang)品(pin)稀(xi)釋至樣(yang)品(pin)接種完畢不得(de)超(chao)過45 min。
8.3 培養
8.3.1 通常情況下, 涂布后, 將平板正置(zhi)于(yu)水(shui)平桌上(shang)10 min~20 min 后翻轉平皿, 放入培養(yang)箱培養(yang),
36 ℃ ±1 ℃ 培養24 h~48 h。
8.3.2 如(ru)果樣液(ye)不(bu)易吸收, 可將平板(ban)正(zheng)置在培(pei)養(yang)箱36 ℃ ±1 ℃ 培養1 h, 等樣品勻液吸收后再翻轉平
皿, 倒(dao)置(zhi)于培養箱,36 ℃ ±1 ℃ 繼續培養24 h~48 h。
8.4 典型菌落計數和確認
8.4.1 選擇有典型或可(ke)疑(yi)單(dan)核細(xi)胞(bao)增生李斯特氏菌菌落(luo)生長的平板(ban), 如果(guo):

a)	只(zhi)有1 個稀釋度(du)的平板合(he)計(ji)典型(xing)或(huo)可疑菌落數在(zai)15 CFU~150 CFU 之間, 應計數該稀釋度平板上的典型或可疑菌落數;

b) 所有稀釋度(du)的平(ping)板合計典型或(huo)可(ke)疑菌(jun)落數均小于15 CFU, 應計數最低稀釋度平板上的典型或
可疑菌落數;

c)	所有稀釋度的平板合(he)計典型或可疑菌落數大于 150 CFU, 應計數最高稀釋度平板上的典型或可疑菌落數;

d) 所有稀釋度的合計平板典(dian)型或可疑菌落數均不在15 CFU~150 CFU 之(zhi)間, 其中一部分小于
15 CFU 或大(da)于150 CFU 時, 應計數最接(jie)近(jin)15 CFU 或150 CFU 的稀釋度平板上的典型或可
疑菌落數;
符合a) ~d) 者按(an)9.1.1 中式(1) 計算。

e)	2 個連續稀釋(shi)度的合(he)計(ji)平(ping)板典型或可疑菌落數均在15 CFU~150 CFU 之(zhi)間, 按9.1.2 中式(2) 計算(suan)。

8.4.2 從每個平板(符(fu)合5.2 要求(qiu)的平板) 中(zhong)挑取5 個典型或可疑菌落(luo)(少于5 個全選) , 按(an)照5.3、5.4、
5.5 進行鑒定。
9 結果與報告
9.1 計數方法
9.1 .1 式(1) :
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GB 4789.30—2025
T = AB
CVd … … … … … … … … … …( 1 )
式中:
T ———樣品(pin)中(zhong)單核(he)細胞(bao)增(zeng)生李斯特(te)氏菌(jun)菌(jun)落數[ CFU/g(mL) ];
A ———計(ji)數稀(xi)釋度典型或可疑菌落的總數;
B ———計(ji)數稀釋(shi)度確(que)證為單(dan)核細胞(bao)增生李斯特氏菌(jun)的菌(jun)落數;
C ———計數(shu)稀釋度(du)用于單核細(xi)胞(bao)增生李斯特(te)氏菌確(que)證試驗的(de)菌落數(shu);
V ———計(ji)數稀(xi)釋度(du)的接種量(liang), 以毫升(mL) 計(ji);
d ———稀釋(shi)因子。
9.1 .2 式(shi)(2) :
T =A1B1/C1 +A2B2/C2
Vd … … … … … … … … … …( 2 )
式中:
T ———樣品(pin)中單核細(xi)胞增生李斯特氏菌菌落(luo)數[ CFU/g(mL) ];
A1 ———第一計(ji)數稀釋度(低稀釋(shi)倍(bei)數) 單核細胞增生(sheng)李斯特(te)氏菌典(dian)型或可疑菌落的總數(shu);
A2 ———第二計數(shu)稀釋度(高(gao)稀釋倍數) 單核細胞增生李斯特(te)氏菌典型(xing)或可疑菌落的總數;
B1 ———第一計(ji)數稀釋(shi)度(低稀釋倍數) 鑒定結果為單核(he)細胞(bao)增生(sheng)李斯特氏菌(jun)的(de)菌(jun)落數;
B2 ———第二(er)計數稀釋度(高稀釋倍數) 鑒定(ding)結果為(wei)單(dan)核細胞增生李斯特氏菌(jun)的菌(jun)落(luo)數;
C1 ———第(di)一計數稀(xi)釋(shi)度(低(di)稀(xi)釋倍數) 用于單核細(xi)胞增生李斯特(te)氏(shi)菌(jun)鑒(jian)定的菌(jun)落數;
C2 ———第二計數稀釋度(高(gao)稀釋(shi)倍數) 用于(yu)單核(he)細胞增生李斯特(te)氏菌(jun)鑒(jian)定的(de)菌(jun)落數;
V ———第一(yi)計數稀釋度接種量(liang)加(jia)第二計數稀釋度1/10 接種量(liang), 以毫升(mL) 計(ji), 如: 接種量采用
0.1 mL 方(fang)法的V 值為0.11; 接種量采用(yong)0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 方法的V 值為(wei)1.1;
d ———稀釋(shi)因子(第(di)一個稀釋度) 。
9.2 結果報告
9.2.1 菌落數小于100 CFU 時, 按“四舍五入”原則(ze)修(xiu)約, 以整數報告。
9.2.2 菌(jun)落數(shu)大于或等于100 CFU 時, 第3 位(wei)數字采(cai)用(yong)“四舍五(wu)入”原則(ze)修(xiu)約后(hou), 取前兩位數(shu)字(zi), 后面用
0 代替位數(shu)。也可用10 的(de)指數形式(shi)來表示, 按“四(si)舍五入”原(yuan)則修約后, 保留兩位有效數字。
9.2.3 報告每g(mL) 樣品中單核(he)細胞(bao)增(zeng)生李斯特(te)氏菌(jun)菌(jun)落數, 以 CFU/g(mL) 表示; 如T 值為0, 接種
量采用0.1 mL 方法(fa)的(de)以小于(yu)10 乘(cheng)以最(zui)低稀釋倍數(shu)報告(gao)。接種量(liang)采用0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 方法的
以小于1 乘以最低(di)稀釋倍數報告。
第三法單核細胞增生李斯特氏菌 MPN 計數法
10 檢驗程序
單核細(xi)胞增生李斯特氏(shi)菌 MPN 計數法檢驗程序見圖3。
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GB 4789.30—2025
圖3 單核細胞增生李斯特氏菌 MPN 計數法檢驗程序
11 操作步驟
11 .1 樣品的稀釋
樣品稀釋液(ye)用(yong)磷酸鹽緩沖液(ye)。樣(yang)品(pin)稀釋(shi)方法同8.1。
11 .2 接種和培養
11 .2.1 根據對(dui)樣品(pin)污(wu)染狀況的估計(ji), 選取3 個(ge)適(shi)宜連續稀釋度的(de)樣品勻(yun)液(ye)(液體樣品可包括原液) , 接
種于10 mL FB1 增菌肉湯, 每一稀(xi)釋度接種3 管, 每管接(jie)種1 mL。如果接(jie)種量為10 mL, 接種至10 mL
雙料 FB1 增菌肉湯。于30 ℃ ±1 ℃ 培養(yang)24 h±2 h。每管(guan)各(ge)吸(xi)取0.1 mL, 轉(zhuan)種于10 mL FB2 增菌肉湯
內, 于30 ℃ ±1 ℃ 培養24 h±2 h。
11 .2.2 用(yong)接種環分別從 FB2 增菌肉湯各管中移取1 環, 接種 OA 李斯特氏(shi)菌(jun)顯色培養基(或其他等效
的李斯特氏菌顯色培養基) 平板,36 ℃ ±1 ℃ 培養24 h~48 h。
11 .3 確證試驗
從每個(ge)平板(符(fu)合5.2 要求的平板) 中(zhong)挑取3 個~5 個(ge)典型或(huo)可疑(yi)菌落(少(shao)于3 個全選(xuan)) , 按照5.3、
5.4、 5.5 進行鑒定(ding)。
12 結果與報告
根(gen)據(ju)證(zheng)實(shi)為單(dan)核細胞增生李(li)斯特氏(shi)菌陽(yang)性的試(shi)管管數, 查 MPN 檢索表( 見附錄 B) , 報告每(mei)克(ke)( 毫
升) 樣品(pin)中(zhong)單核細胞(bao)增生李斯特氏(shi)菌(jun)的(de)最(zui)可能數, 以 MPN/g(mL) 表(biao)示。
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GB 4789.30—2025
附錄 A
培養基和試劑
A.1 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE)
A.1 .1 成分

胰蛋白胨(胰酪胨)
多價胨
酵母膏粉
氯化鈉
磷酸氫二鉀
葡萄糖
蒸餾水
A.1 .2 制法

17.0 g
3.0 g
6.0 g
5.0 g
2.5 g
2.5 g
1 000 mL

將上述各成分加熱攪拌溶解, 必要時調(diao)節pH, 分(fen)裝(zhuang),121 ℃ 高壓(ya)滅菌15 min, 備用。培養基滅菌后
25 ℃ 的pH 為(wei)7.2±0.2。
A.2 含0.6%酵母膏粉的胰酪胨大豆瓊脂(TSA-YE)
A.2.1 成分

胰蛋白(bai)胨(胰酪胨)
多價胨
酵母膏粉
氯化鈉
磷酸氫二鉀
葡萄糖
瓊脂
蒸餾水
A.2.2 制(zhi)法

17.0 g
3.0 g
6.0 g
5.0 g
2.5 g
2.5 g
15.0 g
1 000 mL

將上述各成分加熱攪拌溶解, 必要時調節 pH 至7.2 ±0.2, 分(fen)裝(zhuang),121 ℃ 高(gao)壓滅菌(jun)15 min, 冷卻至
47 ℃ ~50 ℃ , 傾倒在無菌的平皿(min)中, 備用。培養(yang)基滅菌后(hou)25 ℃ 的(de)pH 為(wei)7.2±0.2。
A.3 Fraser 增菌肉湯(FB1 、FB2 )
A.3.1 基礎培養基
A.3.1 .1 成分

胰蛋白胨(胰酪(lao)胨)
牛肉膏粉
酵母膏粉
蛋白胨

5.0 g
5.0 g
5.0 g
5.0 g

10
GB 4789.30—2025

氯化鈉
磷酸二氫鉀
磷酸氫二鈉
氯化鋰
七葉苷
蒸餾水
A.3.1 .2 制(zhi)法

20.0 g
1.35 g
12.0 g
3.0 g
1.0 g
1 000 mL

將上述各成分加熱攪拌溶解(jie), 必要時調節(jie)pH, 分裝(zhuang),121 ℃ 高壓滅菌(jun)15 min, 冷卻(que)至47 ℃ ~50 ℃ 。
培養基(ji)滅菌后25 ℃ 的pH 為(wei)7.2±0.2。
A.3.2 添加劑
A.3.2.1 1 %萘啶酮酸溶液
將0.5 g 萘啶酮酸鈉(na)鹽(yan)溶于50 mL0.05 mol/L 氫氧化(hua)鈉中, 并通過(guo)0.45 μm 無菌濾(lv)膜過(guo)濾(lv)除菌。
A.3.2.2 0.25%鹽酸吖啶黃溶液
將0.25 g 鹽(yan)酸吖啶黃溶(rong)于100 mL 蒸(zheng)餾水中(zhong), 用(yong)0.45 μm 的無菌(jun)濾(lv)膜過濾(lv)除菌(jun)。
A.3.2.3 5%檸檬酸鐵銨溶液
將5 g 檸檬酸鐵銨溶于(yu)100 mL 蒸餾水中, 用0.45 μm 的無菌(jun)濾(lv)膜過濾(lv)除菌(jun)。
A.3.3 完全培養基
A.3.3.1 FB1 增菌肉湯

基(ji)礎培養基(ji)(A.3.1) 1%萘啶酮酸(suan)溶液(A.3.2.1) 0.25%鹽酸吖啶黃溶液(A.3.2.2) 5%檸檬酸鐵(tie)銨溶(rong)液(A.3.2.3) A.3.3.2 FB2 增菌肉湯基礎培養基(A.3.1) 1%萘啶酮酸溶液(A.3.2.1) 0.25%鹽酸吖(a)啶黃溶液(A.3.2.2) 5%檸(ning)檬酸鐵銨溶液(A.3.2.3)	984 mL 1 mL 5 mL 10 mL
978 mL 2 mL 10 mL 10 mL
A.4 OA 李斯特氏(shi)菌顯色培養基(Agar Listeriaaccordingto Ottaviani and Agosti)
A.4.1 基礎培養基 A.4.1 .1 成分蛋白胨胰蛋白胨(胰(yi)酪胨) 酵母膏粉丙酮酸鈉葡萄糖	18.0 g 6.0 g 10.0 g 2.0 g 2.0 g

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GB 4789.30—2025

甘油磷酸鎂硫酸鎂(無水) 氯化鈉氯化鋰磷酸氫二鈉(無(wu)水)	1.0 g 0.5 g 5.0 g 10.0 g 2.5 g
5-溴-4-氯-3-吲(yin)哚-β-D-吡喃葡(pu)萄糖苷(gan)(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucopyranoside)
0.05 g 15.0 g 930 mL*	瓊脂蒸餾水注: * 表示如果用兩(liang)性霉素 B 替代環(huan)己(ji)酰亞胺, 基(ji)礎培(pei)養基(ji)配制體積(ji)改為925 mL。

A.4.1 .2 制法
將(jiang)上(shang)述各(ge)成(cheng)分(fen)加熱攪(jiao)拌溶解, 必(bi)要時調節pH, 分裝(zhuang),121 ℃ 高壓滅菌15 min, 冷卻(que)至(zhi)47 ℃ ~50 ℃ 。
培養基滅(mie)菌后25 ℃ 的pH 為(wei)7.2±0.2。
A.4.2 添加劑
A.4.2.1 0.4%萘啶酮酸溶液
將0.02 g 萘(nai)啶(ding)酮(tong)酸(suan)鈉鹽溶于5 mL 氫氧化鈉(na)中, 并(bing)通過0.45 μm 無菌濾膜(mo)過濾除菌。
A.4.2.2 0.4%頭孢他啶溶液
將0.02 g 頭(tou)孢他啶溶(rong)于5 mL 蒸餾(liu)水中(zhong), 用(yong)0.45 μm 的(de)無菌濾膜過濾除菌。
A.4.2.3 多黏菌素 B 溶液
將76 700IU 硫酸多黏菌素(su) B 溶(rong)于(yu)5 mL 蒸餾水中, 用(yong)0.45 μm 的(de)無菌濾膜過濾除菌。
A.4.2.4 2%環己酰亞胺溶液
將(jiang)0.05 g 環己酰亞(ya)胺(an)溶于2.5 mL 無水乙醇中, 然后(hou)加蒸餾(liu)水(shui) 2.5 mL, 用(yong)0.45μm 的無菌濾膜過濾
除菌。
A.4.2.5 0.1 %兩性霉素 B 溶液(作為環己酰亞胺溶液的替代品)
將2.5 mL 鹽酸(suan)(1 mol/L) 和7.5 mL 二(er)甲基甲酰胺(DMF) 混合(he)成 HCl/DMF 溶液, 加(jia)0.01 g 兩性
霉素溶解后, 用(yong)0.45 μm 的無菌濾膜(mo)過(guo)濾除菌。
A.4.2.6 L-α-磷脂酰肌醇溶液
將2 g 的L-α-磷脂酰肌醇(chun)溶于50 mL 的蒸餾水中(可(ke)以使用2 g 含有9%~15%的未分級磷脂酰肌
醇的大豆卵磷脂代替 L-α-磷(lin)脂酰肌醇) , 攪(jiao)拌(ban)約30 min 直(zhi)至獲得均勻(yun)的懸(xuan)浮液(ye)。在121 ℃ 下高壓滅菌
15 min, 然后(hou)冷(leng)卻(que)至47 ℃ ~50 ℃ 。
A.4.3 完全培養基
A.4.3.1 成分

基礎培養基(A.4.1)
0.4%萘啶(ding)酮酸(suan)溶液(A.4.2.1)
0.4%頭孢(bao)他啶溶液(A.4.2.2)

930 mL
5 mL
5 mL

12
GB 4789.30—2025

多黏菌素 B 溶液(A.4.2.3)
2%環己酰亞胺溶液(A.4.2.4)
或0.1%兩性霉素(su) B 溶液(A.4.2.5)
L-α-磷(lin)脂(zhi)酰肌(ji)醇溶液(A.4.2.6)

5 mL
5 mL
10 mL
50 mL

在基礎培(pei)養基(A.4.1) 冷卻至(zhi)47 ℃ ~50 ℃ 時, 依次加(jia)入萘啶酮(tong)酸、頭孢他啶、多黏菌素B、環己酰亞
胺或兩性霉素 B、L-α-磷脂酰肌醇溶液。每次添加均(jun)需要立即充(chong)分混(hun)合均(jun)勻。完全培養(yang)基的(de) pH 在
25 ℃ 下(xia)應為(wei)7.2±0.2, 介質應均勻呈輕微(wei)乳白色。混勻后傾倒在無菌的(de)平皿(min)中, 每個培養皿中倒入
18 mL~20 mL, 凝固后備用。
A.5 PALCAM 培養基
A.5.1 成分

酵母膏粉
葡萄糖
七葉苷
檸檬酸鐵銨
甘露醇
酚紅
氯化鋰
酪蛋白胰酶消化物(酪蛋白胨)
心胰酶消化物
玉米淀粉
肉胃酶消化物
氯化鈉
瓊脂
蒸餾水
A.5.2 制(zhi)法(fa)

8.0 g
0.5 g
0.8 g
0.5 g
10.0 g
0.1 g
15.0 g
10.0 g
3.0 g
1.0 g
5.0 g
5.0 g
15.0 g
1 000 mL

將上述各成分加熱攪拌溶(rong)解, 必要時調節pH, 分裝,121 ℃ 高壓滅菌15 min。培養(yang)基滅菌后(hou)25 ℃
的pH 為7.2±0.2。
A.5.2.1 PALCAM 選擇性添加劑

多黏菌素 B
鹽酸吖啶黃
頭孢他啶
無菌蒸餾水
A.5.2.2 制法

10.0 mg
5.0 mg
20.0 mg
2 mL

將(jiang)PALCAM 基礎(chu)培養基冷卻至47 ℃ ~50 ℃ , 加(jia)入2 mL PALCAM 選擇性添加劑(ji), 混勻后傾倒在
無菌的平皿中, 每個培養(yang)皿中倒入18 mL~20 mL, 凝固后(hou)備用(yong)。
13
GB 4789.30—2025
A.6 革蘭氏染色液
A.6.1 結晶紫染色液
A.6.1 .1 成分

結晶紫
95% 乙醇
1% 草酸銨水溶液
A.6.1 .2 制法(fa)

1.0 g
20.0 mL
80.0 mL

將結晶紫完全溶解于乙醇中, 然后與草酸銨(an)水溶液混(hun)合。
A.6.2 革蘭氏碘液
A.6.2.1 成分

碘
碘化鉀
蒸餾水
A.6.2.2 制法

1.0 g
2.0 g
300 mL

將(jiang)碘(dian)與碘(dian)化鉀(jia)先進行(xing)混(hun)合(he), 加入少(shao)許蒸餾水, 充分振搖, 待(dai)完全溶解后, 再加(jia)蒸餾水至300 mL。
A.6.3 沙黃復染液
A.6.3.1 成分

沙黃
95%乙醇
蒸餾水
A.6.3.2 制法
將沙(sha)黃溶解于乙(yi)醇中, 然后用(yong)蒸餾(liu)水稀釋(shi)。
A.6.4 染色法(fa)

0.25 g
10.0 mL
90.0 mL

A.6.4.1 涂片用火焰固(gu)定(ding)后滴加結晶紫(zi)染液, 作用1 min, 水洗。
A.6.4.2 滴加革蘭氏碘(dian)液(ye), 作用(yong)1 min, 水洗。
A.6.4.3 滴加(jia)95%乙醇脫色(se)15 s~30 s, 直至染(ran)色(se)液被洗掉, 不(bu)要過分脫(tuo)色, 水洗。
A.6.4.4 滴加復染液(ye), 復染(ran) 1 min, 水洗、待干(gan)、鏡檢(jian)。
A.7 SIM 動力培養基
A.7.1 成分

胰(yi)蛋白胨(胰酪胨)
多價胨
硫酸鐵銨

20.0 g
6.0 g
0.2 g

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GB 4789.30—2025

硫代硫酸鈉
瓊脂
蒸餾水
A.7.2 制法(fa)

0.2 g
3.5 g
1 000 mL

將上述(shu)各成分(fen)加熱攪拌溶解(jie), 必要時調(diao)節(jie)pH, 分裝小試管,121 ℃ 高(gao)壓(ya)滅菌(jun)15 min, 備用。培養基
滅菌后25 ℃ 的pH 為7.2±0.2。
A.8 緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅(MR) 和乙酰甲基醇(VP) 試驗用]
A.8.1 成分

多價胨
葡萄糖
磷酸氫二鉀
蒸餾水
A.8.2 制法

7.0 g
5.0 g
5.0 g
1 000 mL

將(jiang)上述各(ge)成分加熱攪拌溶解, 必要(yao)時(shi)調節pH, 分裝試管(guan), 每管(guan)1 mL。 121 ℃ 高壓滅菌15 min, 備
用。緩沖葡萄糖(tang)蛋白胨水(shui)滅菌(jun)后25 ℃ 的pH 為7.2±0.2。
A.8.3 甲基紅(MR) 試驗
A.8.3.1 甲基紅試劑
A.8.3.1 .1 成分

甲基紅
95% 乙醇
蒸餾水
A.8.3.1 .2 制法(fa)

10 mg
30 mL
20 mL

10 mg 甲基(ji)紅溶(rong)于(yu)30 mL95%乙醇中, 然(ran)后加入20 mL 蒸餾水(shui)。
A.8.3.1 .3 試驗方法
取適量(liang)瓊脂(zhi)培養物接種于緩沖葡萄糖蛋白胨水(shui)中,36 ℃ ±1 ℃ 培(pei)養(yang)2 d~5 d。滴加甲基紅試劑
1 滴(di), 立即(ji)觀察(cha)結果。鮮紅色為(wei)陽性(xing), 黃色為(wei)陰性。
A.8.4 乙酰甲基甲醇(VP) 試驗
A.8.4.1 6%α-萘酚-乙醇溶液
成分及制法: 取(qu)α-萘酚6.0 g, 加(jia)無水(shui)乙醇溶解(jie), 定容至(zhi)100 mL。
A.8.4.2 40%氫氧化鉀溶液
成分及制(zhi)法(fa): 取氫氧(yang)化鉀40 g, 加蒸餾水溶解, 定容至100 mL。
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GB 4789.30—2025
A.8.4.3 試驗方法
取(qu)適量(liang)瓊脂培養物(wu)接(jie)種于緩沖葡萄糖蛋白胨水中,36 ℃ ±1 ℃ 培(pei)養(yang)2 d~4 d, 加入6% α-萘酚-乙醇
溶液0.5 mL 和40%氫(qing)氧化鉀溶液0.2 mL, 充分振搖試管, 觀察(cha)結果(guo)。陽性反應立刻或于數分鐘內出現
紅色, 如為陰(yin)性(xing), 應放在36 ℃ ±1 ℃ 繼續培養1 h 再進行(xing)觀察(cha)。
A.9 羊血瓊脂
A.9.1 成分

蛋白胨
牛肉膏
氯化鈉
瓊脂
蒸餾水
脫纖維羊血
A.9.2 制法(fa)

1.0 g
0.3 g
0.5 g
1.5 g
100 mL
5 mL~8 mL

除新鮮脫纖維羊血外, 加熱溶(rong)化(hua)上述各組分(fen),121 ℃ 高壓滅菌15 min, 冷至50 ℃ , 以無菌操作加入
新鮮脫纖維羊血, 搖勻(yun), 傾注平板。
A.10 無菌磷酸鹽緩沖液
A.10.1 儲存液成分

磷酸二氫鉀(KH2PO4 )
1 mol/L 氫氧化鈉
蒸餾水
A.10.2 制(zhi)法

34.0 g
約175 mL
1 000 mL

A.10.2.1 1 mol/L 氫氧(yang)化鈉: 稱取20.0 g 的(de)氫氧化鈉溶于500 mL 蒸餾水中(zhong)。
A.10.2.2 儲存液(ye): 稱取34.0 g 的磷酸二(er)氫鉀溶于500 mL 蒸餾(liu)水中, 用大約175 mL 的1 mol/L 氫氧
化鈉溶液調節pH 至7.2, 用蒸餾水定容至1 000 mL 后儲(chu)存于冰箱。
A.10.2.3 工作液(ye): 取儲存液1.25 mL, 用蒸餾(liu)水稀釋至1 000 mL, 分(fen)裝于適宜(yi)容器中,121 ℃ 高壓滅菌
15 min。
A.11 無菌生理鹽水
A.11 .1 成分

氯化鈉
蒸餾水
A.11 .2 制法

8.5 g
1 000 mL

稱(cheng)取8.5g 的(de)氯化鈉溶(rong)于1 000 mL 蒸(zheng)餾水中, 分(fen)裝于適宜容器中,121 ℃ 高壓滅菌15 min。
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GB 4789.30—2025
A.12 糖發酵管
A.12.1 糖發酵基礎肉湯

牛肉膏
蛋白胨
氯化鈉
十二水磷酸氫二鈉(Na2 HPO4 · 12H2O)
0.2%溴麝香草酚藍溶液
蒸餾水
A.12.2 制法

5.0 g
10.0 g
3.0 g
2.0 g
12.0 mL
1 000 mL

A.12.2.1 將上述各(ge)成分加熱攪拌溶解, 必要(yao)時調節(jie)pH, 分(fen)裝(zhuang)每(mei)瓶100 mL,121 ℃ 高(gao)壓滅(mie)菌15 min, 備
用。糖發酵基礎(chu)肉湯滅菌后(hou)25 ℃ 的pH 為7.4±0.2。
A.12.2.2 葡萄糖(tang)發酵管: 用蒸餾(liu)水將葡(pu)萄糖配制成10% 溶液,121 ℃ 高壓滅菌15 min。無菌吸取5
mL 葡萄糖溶(rong)液加入按 A.12.2.1 配(pei)制的(de)100 mL 糖發酵基礎肉(rou)湯(tang)內, 混勻后, 以無菌操作分裝于小試管
中, 備用。葡萄糖發酵(jiao)管25 ℃ 的pH 為7.4±0.2。
A.12.2.3 其他各種糖發酵(jiao)管: 可(ke)按照 A.12.2.2 葡萄糖發酵(jiao)管(guan)的配制(zhi)方法制(zhi)備其他糖類發酵(jiao)管(guan)。
A.12.3 試驗方法
取適(shi)量純培養物接種于糖(tang)發酵管,36 ℃ ±1 ℃ 培養24 h~48 h, 觀察(cha)結果, 藍(lan)色為陰性, 黃色為
陽性。
A.13 過氧化氫試劑
A.13.1 試劑
3%過氧化氫溶液, 臨用配制。
A.13.2 過氧化氫酶試驗方法
用細玻璃(li)棒(bang)或一次性接種(zhong)針挑取單個菌落, 置(zhi)于潔凈玻璃(li)平皿內, 滴加3% 過氧(yang)化氫溶液2 滴, 觀
察結果。
A.13.3 結果
于0.5 min 內發生氣泡者為陽性(xing), 不發(fa)生(sheng)氣(qi)泡者為(wei)陰性(xing)。
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GB 4789.30—2025
附錄 B
單核細胞增生李斯特氏菌最可能數(MPN) 表
每克(毫升) 檢樣中單核(he)細胞增生(sheng)李斯特氏菌(jun)最可(ke)能數(MPN) 的(de)檢索見表(biao) B.1。
表 B.1 單核細胞增生李斯特氏菌最可能數(MPN) 檢索表

陽性管數	MPN	95% 置信區間(jian)	陽性管數	MPN	95% 置信區(qu)間
0.10	0.01	0.001	下限	上限	0.10	0.01	0.001	下(xia)限	上限
0	0	0	<3.0	—	9.5	2	2	0	21	4.5	42
0	0	1	3.0	0.15	9.6	2	2	1	28	8.7	94
0	1	0	3.0	0.15	11	2	2	2	35	8.7	94
0	1	1	6.1	1.2	18	2	3	0	29	8.7	94
0	2	0	6.2	1.2	18	2	3	1	36	8.7	94
0	3	0	9.4	3.6	38	3	0	0	23	4.6	94
1	0	0	3.6	0.17	18	3	0	1	38	8.7	110
1	0	1	7.2	1.3	18	3	0	2	64	17	180
1	0	2	11	3.6	38	3	1	0	43	9	180
1	1	0	7.4	1.3	20	3	1	1	75	17	200
1	1	1	11	3.6	38	3	1	2	120	37	420
1	2	0	11	3.6	42	3	1	3	160	40	420
1	2	1	15	4.5	42	3	2	0	93	18	420
1	3	0	16	4.5	42	3	2	1	150	37	420
2	0	0	9.2	1.4	38	3	2	2	210	40	430
2	0	1	14	3.6	42	3	2	3	290	90	1 000
2	0	2	20	4.5	42	3	3	0	240	42	1 000
2	1	0	15	3.7	42	3	3	1	460	90	2 000
2	1	1	20	4.5	42	3	3	2	1 100	180	4 100
2	1	2	27	8.7	94	3	3	3	>1 100	420	—
注1 : 本表(biao)采用3 個稀釋(shi)度[0.1 g(mL) 、0.01 g(mL) 和0.001 g(mL) ], 每個稀(xi)釋度(du)接種3 管(guan)。注2: 表(biao)內所列(lie)檢樣量(liang)如(ru)改用1 g(mL) 、0.1 g(mL) 和0.01 g(mL) 時, 表內(nei)數字應(ying)相應(ying)降(jiang)低(di)10 倍(bei); 如改用0.01 g (mL) 、0.001 g(mL) 、0.000 1 g(mL) , 則表內數字應相應增高10 倍, 其余(yu)類推

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GB/T 4789.30-2025 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗

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