中 華 人 民 共 和 國 國 家 標 準

GB 4789.12—2025

食品安全國家標準

食品微生物學檢驗

產肉毒毒素梭菌及肉毒毒素檢驗

2025-09-02 發布 2026-03-02 實施

中華人民共和國國家衛生健康委員會

國 家 市 場 監 督 管 理 總 局 發 布

前 言

本標準代替 GB4789.12—2016《 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 肉毒梭菌及肉毒毒素檢

驗》。

本標準與 GB4789.12—2016 相比, 主要變化如下:

———增加了術語和定義;

———增加了梭菌實時熒光 PCR 鑒定方法;

———修改了標準名稱;

———修改了范圍;

———修改了設備和材料、 培養基和試劑;

———修改了檢驗程序、 操作步驟、 結果與報告及附錄。

Ⅰ

GB 4789.12—2025

食品安全國家標準

食品微生物學檢驗

產肉毒毒素梭菌及肉毒毒素檢驗

1 范圍

本標準規定了食品中產肉毒毒素梭菌及肉毒毒素(botulinum neurotoxin) 的檢驗方法。

本標準適用于食品中產肉毒毒素梭菌及肉毒毒素的檢驗。

2 術語和定義

產肉毒毒素梭菌

革蘭氏陽性厭氧桿菌, 能形成卵圓形芽孢, 一般芽孢會大于菌體、 位于次端, 在適宜培養條件下能產

生肉毒毒素的一類細菌的統稱。 包含肉毒梭菌(Clostridium botulinum ) 、 丁酸梭菌(Clostridium butyricum) 等。

3 設備和材料

除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外, 其他設備和材料如下。

3.1 冰箱:2 ℃ ~8 ℃ 、 -18℃ ~-20 ℃ 、 -80 ℃ 。

3.2 天平: 感量0.1 g、0.001 g。

3.3 pH 計、pH 比色管或精密pH 試紙。

3.4 無菌剪刀、 鑷子、 試劑勺。

3.5 均質器或無菌乳缽。

3.6 離心機:3 000 g 、14 000 g 。

3.7 厭氧培養裝置: 厭氧培養箱、 厭氧罐、 厭氧袋或提供同等厭氧效果的裝置。

3.8 恒溫培養箱:36 ℃ ±1 ℃ 、28 ℃ ±1 ℃ 。

3.9 恒溫裝置:36 ℃ ±1 ℃ 、60 ℃ ±1 ℃ 、80 ℃ ±1 ℃ 、100 ℃ ±1 ℃ 。

3.10 顯微鏡:100× ~1000× 。

3.11 普通 PCR 儀和實時熒光 PCR 儀。

3.12 普通電泳儀或毛細管電泳儀。

3.13 凝膠成像系統或紫外檢測儀。

3.14 核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。

3.15 微量移液器及配套滅菌吸頭:2 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL。

3.16 無菌吸管:1 mL(具0.01 mL 刻度) 、10 mL(具0.1 mL 刻度) 、25 mL(具0.1 mL 刻度) 。

3.17 無菌錐形瓶:100 mL。

3.18 培養皿: 直徑90 mm。

3.19 離心管:1.5 mL、5 mL、50 mL 。

3.20 無菌濾器: 濾膜孔徑0.45 μm、0.22 μm。

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3.21 PCR 反應管。

3.22 無菌注射器:1 mL。

3.23 小鼠: 體重15 g~20 g, 每一批次試驗應使用同一品系單一性別的 KM(昆明) 或ICR 小鼠, 同性別

小鼠個體間體重相差不超過平均體重的±20%, 且如是雌性動物應未交配、 未妊娠。

4 培養基和試劑

除另有規定 外, PCR 試 驗 所 用 試 劑 為 分 析 純 或 符 合 生 化 試 劑 標 準, 培 養 基 制 備 用 水 應 符 合

GB4789.28中的要求。

4.1 生理鹽水: 見 A.1。

4.2 庖肉培養基: 見 A.2。

4.3 胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉湯(TPGYT) 培養基: 見 A.3。

4.4 卵黃瓊脂培養基: 見 A.4。

4.5 哥倫比亞血瓊脂培養基: 見 A.5。

4.6 明膠磷酸鹽緩沖液: 見 A.6。

4.7 磷酸鹽緩沖液(PBS) : 見 A.7。

4.8 革蘭氏染色液: 見 A.8。

4.9 胰蛋白酶: 活力為1∶ 250 或0.25%。

4.10 肉毒毒素診斷血清: 混合型、A 型、B 型、E 型、F 型。

4.11 1 mol/L 氫氧化鈉。

4.12 1 mol/L 鹽酸。

4.13 無水乙醇和95%乙醇。

4.14 10 mg/mL 溶菌酶溶液。

4.15 10 mg/mL 蛋白酶 K 溶液。

4.16 3 mol/L 乙酸鈉溶液(pH 5.2) 。

4.17 TE 緩沖液。

4.18 引物和探針: 臨用時用滅菌超純水或 TE 緩沖液配制成濃度為10 μmol/L。

4.19 10×PCR 緩沖液:0.5 mmol/L KCl、0.1 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3) 、0.015 mmol/L MgCl2 。

4.20 25 mmol/L MgCl2 。

4.21 dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP 濃度均為10 mmol/L。

4.22 Taq DNA 聚合酶:5 U/μL。

4.23 瓊脂糖: 電泳級。

4.24 溴化乙錠、Goldview 或其他核酸染料。

4.25 5×TBE 或10×TAE 緩沖液。

4.26 6× 加樣緩沖液。

4.27 DNA 分子質量標準: 涵蓋目標條帶長度。

5 檢驗程序

產肉毒毒素梭菌及肉毒毒素檢驗程序見圖1。

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注: 報告(一) : 樣品中未檢出或檢出(某型別) 肉毒毒素; 報告(二) : 樣品中未檢出或檢出產(某型別) 肉毒毒素梭菌;

報告(三) : 樣品中未檢出或檢出產(某型別) 肉毒毒素的某種梭菌。

圖 1 產肉毒毒素梭菌及肉毒毒素檢驗程序

6 操作步驟

6.1 樣品制備

固態、 半固態及難吸取的液態食品, 以無菌操作稱取25 g, 放入無菌均質袋或無菌乳缽, 塊狀食品以

無菌操作切碎。 含水量較高的食品加入25 mL 明膠磷酸鹽緩沖液, 乳粉、 牛肉干等含水量低的食品加

入50 mL(或更多, 稀釋液體積可根據樣品水分含量酌情增減, 一般稀釋至可接種即可) 明膠磷酸鹽緩沖

液, 浸泡30 min, 用拍擊式均質器拍打1 min~2 min 或用無菌研杵研磨制備樣品勻液, 收集備用。

易吸取的液態食品搖勻后取25 mL 備用。

注: 取樣后的剩余樣品放2 ℃ ~8 ℃ 冷藏保存, 直至檢驗報告發出后, 檢出陽性的樣品采用壓力蒸汽滅菌方式進行

無害化處理, 建議121 ℃ 高壓蒸汽滅菌30 min 以上。

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6.2 肉毒毒素檢驗

6.2.1 毒素液制備

取6.1 中制備的樣品勻液約 30 mL 或均勻液體樣品 25 mL 放入無菌離心管中,3 000 g 離心

10 min~20 min, 收集上清液分為兩份放入無菌試管中, 一份直接用于毒素檢測, 另一份按6.2.2 用胰蛋

白酶處理后進行毒素檢測。

6.2.2 胰蛋白酶處理上清液的制備

用1 mol/L 氫氧化鈉或1 mol/L 鹽酸調節上清液pH 至6.2±0.2, 按9 份上清液加1 份胰蛋白酶

(活力1∶ 250) 溶液, 混勻,36 ℃ ±1 ℃ 孵育1 h, 期間間或輕輕搖動反應液。

6.2.3 毒素檢出

用1 mL 注 射 器 分 別 取 離 心 上 清 液 和 胰 蛋 白 酶 處 理 上 清 液 分 別 腹 腔 注 射 小 鼠 各 3 只, 每 只

0.5 mL, 觀察和記錄小鼠48 h 內的中毒表現。 典型肉毒毒素中毒癥狀通常在24 h 內出現, 多數在6 h

內發病和死亡, 其主要表現為豎毛, 四肢癱軟, 呼吸困難、 呈現風箱式呼吸, 腰腹部凹陷、 宛如蜂腰, 多因

呼吸衰竭而死亡, 可初步判定為肉毒毒素所致。 若小鼠在24 h 后發病或死亡, 應仔細觀察小鼠癥狀, 必

要時采用低溫 蒸 發 等 方 法 濃 縮 上 清 液 重 復 試 驗, 以 確 認 肉 毒 毒 素 中 毒。 若 小 鼠 出 現 猝 死 ( 注 射 后

30 min 內) 導致肉毒毒素中毒癥狀不明顯時, 應用明膠磷酸鹽緩沖液對毒素上清液進行適當稀釋, 重復

試驗。

6.2.4 毒素確證

上清液或(和) 胰蛋白酶處理上清液的毒素試驗陽性者, 取相應陽性試驗液3 份, 每份0.5 mL, 其中

第一份加等量混合型肉毒毒素診斷血清, 混勻,36 ℃ ±1 ℃ 孵育30 min~45 min; 第二份加等量明膠磷

酸鹽緩沖液, 混勻后煮沸10 min; 第三份加等量明膠磷酸鹽緩沖液, 混勻。 將3 份混合液分別腹腔注射

小鼠各2 只, 每只0.5 mL, 觀察96 h 內小鼠的中毒和死亡情況。

若注射第一份和第二份混合液的小鼠未死亡, 而第三份混合液小鼠發病死亡, 并出現肉毒毒素中毒

的典型癥狀, 則判定檢測樣品中檢出肉毒毒素。

6.2.5 毒力測定(如需開展, 可按以下條款執行)

取6.2.4 中確證陽性的上清液, 用明膠磷酸鹽緩沖液制備一定稀釋倍數的稀釋液, 如10 倍、50 倍、

100 倍、500 倍等, 分別腹腔注射小鼠各2 只, 每只0.5 mL, 觀察96 h 內小鼠的中毒和死亡情況, 計算最

低致死劑量(minimumlethal dose, MLD) , 以 MLD/mL 或 MLD/g 表示, 評估樣品中肉毒毒素毒力,

MLD 等于小鼠全部死亡的最高稀釋倍數乘以樣品稀釋倍數。 例如, 樣品稀釋兩倍制備的上清液, 再稀

釋100 倍 組 的 小 鼠 全 部 死 亡, 而 500 倍 稀 釋 液 組 的 存 活, 則 該 樣 品 毒 力 為 200 MLD/g 或

200 MLD/mL。

6.2.6 毒素定型(如需開展, 可按以下條款執行)

根據毒力測定結果, 用明膠磷酸鹽緩沖液將上清液稀釋至10 MLD/mL~1 000 MLD/mL 用于定

型試驗, 分別與各單型肉毒毒素診斷血清等量混合( 國產診斷血清一般為凍干血清, 用1 mL 生理鹽水

溶解) ,36 ℃ ±1 ℃ 孵育30 min~45 min, 分別腹腔注射小鼠2 只, 每只0.5 mL, 觀察96 h 內小鼠的中

毒和死亡情況。 同時, 用明膠磷酸鹽緩沖液代替診斷血清, 與上清液等量混合作為小鼠試驗對照。 當某

一單型診斷血清組動物未發病且正常存活, 而對照組和其他單型診斷血清組動物發病死亡, 則判定樣品

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中所含肉毒毒素為該型肉毒毒素。

注: 未經胰蛋白酶激活處理的樣品上清液的毒素檢出或確證試驗為陽性者, 則毒力測定和定型試驗可省略胰蛋白

酶處理試驗。

6.3 產肉毒毒素梭菌檢驗

6.3.1 增菌培養

6.3.1 .1 取庖肉培養基4 支和 TPGY 培養基2 支, 隔水煮沸15 min, 排除溶解氧, 迅速冷卻, 切勿搖

動, 在 TPGY 培養基中緩慢加入胰蛋白酶溶液至液面下肉湯中, 每支1 mL, 制備成 TPGYT 培養基。

6.3.1 .2 吸取6.1 制備的樣品勻液接種至庖肉培養基和 TPGYT 培養基, 每管接種2 mL。 每份樣品接

種4 支庖 肉 培 養 基, 其 中 2 支 直 接 放 置 36 ℃ ±1 ℃ 厭 氧 培 養 5 d, 另 2 支 放 置 80 ℃ ±1 ℃ 保 溫

10 min, 再放置36 ℃ ±1 ℃ 厭氧培養5 d; 接種2 支 TPGYT 培養基,28 ℃ ±1 ℃ 厭氧培養5 d。

注: 接種時, 用無菌吸管輕輕吸取樣品勻液或離心沉淀懸浮液, 將吸管口小心插入肉湯管底部, 緩緩放出樣液至肉

湯中, 切勿攪動或吹氣。

6.3.1 .3 檢查記錄增菌培養物的濁度、 產氣、 肉渣顆粒消化情況, 并注意氣味。 部分產肉毒毒素梭菌培

養物為肉湯混濁、 產氣、 消化肉粒、 有異臭味。

6.3.1 .4 取增菌培養物進行革蘭氏染色鏡檢, 觀察菌體形態, 注意是否有芽孢、 芽孢的相對比例、 芽孢在

細胞內的位置。

6.3.1 .5 若增菌培養物5 d 無菌生長, 應延長培養至10 d, 觀察生長情況。

6.3.1 .6 取有菌生長且有芽孢的陽性管上清液, 按6.2 的方法進行毒素檢出和確證試驗, 必要時進行毒

素定型試驗, 陽性結果可證明樣品中有產肉毒毒素梭菌存在。

6.3.2 分離與純化培養

6.3.2.1 吸取1 mL 有菌生長且有芽孢的陽性管增菌液至無菌管中, 加入1 mL 無水乙醇, 混勻, 在室溫

下放置1 h。

6.3.2.2 取經乙醇處理的增菌液分別劃線接種至卵黃瓊脂平板和哥倫比亞血瓊脂平板,36 ℃ ±1 ℃ 厭

氧培養24 h~48 h。

6.3.2.3 觀察平板培養基上菌落形態。 在卵黃瓊脂平板上, 產肉毒毒素梭菌菌落呈隆起或扁平、 光滑或

粗糙, 易蔓延生長, 邊緣不規則, 在菌落周圍形成乳色沉淀暈圈, 在斜射光下觀察, 菌落表面呈現珍珠樣

虹彩, 這種光澤區可隨蔓延生長擴散到不規則邊緣區外的暈圈, 部分型別菌株周圍形成的乳色沉淀暈

圈、 珍珠樣虹彩光澤不明顯。 在哥倫比亞血瓊脂平板上, 產肉毒毒素梭菌呈圓形、 半透明扁平菌落, 邊緣

整齊或不整齊, 易蔓延生長, 部分型別菌株也可形成白色隆起、 不蔓延生長菌落。

6.3.2.4 在分離培養平板上選擇5 個梭菌可疑菌落(少于5 個時則全選) , 劃線接種卵黃瓊脂平板或哥

倫比亞血瓊脂平板,36 ℃ ±1 ℃ 厭氧培養24 h~48 h, 按6.3.2.3 觀察菌落形態及其純度。

6.3.3 鑒定試驗

6.3.3.1 染色鏡檢

挑取可疑單個菌落進行涂片、 革蘭氏染色和鏡檢。 產肉毒毒素梭菌菌體形態為革蘭氏陽性桿菌、 芽

孢卵圓形、 一般芽孢會大于菌體且位于次端, 菌體呈網球拍狀。

6.3.3.2 毒素編碼基因檢測

挑取6.3.3.1 中典型菌落進行毒素編碼基因檢測。

a) 菌株培養: 挑取可疑菌落或待鑒定菌株接種 TPGY 培養基,28 ℃ ±1 ℃ 厭氧培養20 h~24 h。

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b) DNA 模板制備: 吸取 TPGY 培養液1.4 mL 至無菌離心管中,14000 g 離心2 min, 棄上清, 加

入1.0 mL PBS 懸 浮 菌 體,14 000 g 離 心 2 min, 棄 上 清, 用 400 μL PBS 重 懸 沉 淀, 加 入

10 mg/mL 溶菌酶溶液100 μL, 搖勻,36 ℃ ±1 ℃ 恒溫裝置中放置15 min, 加入10 mg/mL 蛋

白酶 K 溶液10 μL, 搖勻,60 ℃ ±1℃ 恒溫裝置1 h, 在100 ℃ 恒溫裝置中放置10 min 后經

14 000 g 離心2 min, 上清液轉移至無菌小離心管中, 加入3 mol/L 乙酸鈉溶液50 μL 和95%

乙醇1.0 mL, 搖勻, -80 ℃ 或-20 ℃ 放置30 min,14 000 g 離心10 min, 棄去上清液, 沉淀干

燥后溶于200 μL TE 緩沖液, 作為 DNA 模板使用。

注: 根據實驗室實際情況, 也可采用商品化試劑盒制備 DNA 模板。

c) 核酸濃度測定(必要時) : 取5 μL DNA 模板溶液, 加超純水稀釋至1 mL, 用核酸蛋白分析儀或

紫外分光光度計分別檢測260 nm 和280 nm 波段的吸光值 A260 和 A280 。 按式(1) 計算 DNA

質量濃度。 當質量濃度在0.34 μg/mL~340 μg/mL 或 A260/A280 在1.7~1.9 之間時, 適宜于

PCR 擴增。

C =A260 × N ×50 … … … … … … … … … …( 1 )

式中:

C ———DNA 質量濃度, 單位為微克每毫升(μg/mL) ;

A260———260 nm 處的吸光值;

N ———核酸稀釋倍數。

d) PCR 擴增:

1) 分別采用針對各型肉毒毒素編碼基因設計的特異性引物(見表1) 進行 PCR 擴增, 包括 A

型肉毒毒素(botulinum neurotoxin A,BoNT/A) 、B 型肉毒毒素(botulinum neurotoxin

B,BoNT/B) 、E 型肉毒毒素(botulinum neurotoxin E,BoNT/E) 和 F 型肉毒毒素(botulinum neurotoxin F,BoNT/F) 共計四型肉毒毒素編碼基因, 每個 PCR 反應管檢測一種型

別的肉毒毒素編碼基因。

表 1 肉毒毒素編碼基因PCR 檢測的引物序列及其產物

肉毒毒素編

碼基因型別

引物 序列(5’-3’ )

擴增長度/

bp

序列位置

A 型

上游引物 GTG ATA CAA CCA GAT GGT AGT TAT AG

下游引物 AAA AAA CAA GTC CCA ATT ATT AAC TTT

983

GenBank 號: CP046450.1

位置:1 596 654-1 597 636

B 型

上游引物 GAG ATG TTT GTG AAT ATT ATG ATC CAG

下游引物 GTT CAT GCA TTA ATA TCA AGG CTG G

492

GenBank 號: CP014219.1

位置:927 932-928 423

E 型

上游引物 CCA GGC GGT TGT CAA GAA TTT TAT

下游引物 TCA AAT AAA TCA GGC TCT GCT CCC

410

GenBank 號: CP010521.1

位置:1 165 510-1 165 919

F 型

上游引物 GCT TCA TTA AAG AAC GGA AGC AGT GCT

下游引物 GTG GCG CCT TTG TAC CTT TTC TAG G

1137

GenBank 號: CP022400.1

位置:2 177 283-2 178419

2) 反應體系配制見表2, 反應體系中各試劑的量可根據具體情況或不同的反應總體積進行

相應調整。

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表 2 肉毒毒素編碼基因PCR 檢測的反應體系

試劑 終濃度 加入體積/μL

10×PCR 緩沖液 1× 5.0

25 mmol/L MgCl2 2.5 mmol/L 5.0

10 mmol/L dNTPs 0.2 mmol/L 1.0

10 μmol/L 正向引物 0.5 μmol/L 2.5

10 μmol/L 反向引物 0.5 μmol/L 2.5

Taq DNA 聚合酶 0.05 U/μL 0.5

DNA 模板 — 1.0

ddH2O — 32.5

總體積 — 50.0

注: 也能使用商品化試劑盒進行反應體系配制。

3) 反應程序: 預變性95 ℃ 、5 min; 循環參數94 ℃ 、1 min,60 ℃ 、1 min,72 ℃ 、1 min; 循環數

40; 后延伸72 ℃ 、10 min。

4) PCR 擴增體系應設置陽性對照、 陰性對照和空白對照。 用含有已知產肉毒毒素梭菌菌株

DNA 或含肉毒毒素編碼基因的質控品作陽性對照, 非產肉毒毒素梭菌基因組 DNA 作陰

性對照, 無菌水作空白對照。

e) 凝膠電泳檢測 PCR 擴增產物: 用0.5×TBE 或1×TAE 緩沖液配制1.2% ~1.5% 的瓊脂糖凝

膠, 凝膠加熱融 化 后 冷 卻 至 60 ℃ 左 右 加 入 相 應 體 積 的 核 酸 染 料 ( 溴 化 乙 錠 0.5 μg/mL、

Goldview5 μL/100 mL 或其他核酸染料) 制備膠塊, 取10 μLPCR 擴增產物與2.0 μL6× 加樣

緩沖液混合, 點樣, 其中一孔加入 DNA 分子質量標準。 0.5 × TBE 或1 × TAE 電泳緩沖液,

10 V/cm恒壓電泳, 根據溴麝香草酚藍的移動位置確定電泳時間, 用紫外檢測儀或凝膠成像系

統觀察和記錄結果。 PCR 擴增產物也可采用毛細管電泳儀進行檢測。

f) 結果判定: 陰性對照和空白對照均未出現條帶, 陽性對照出現預期大小的擴增條帶( 表1) , 判

定本次 PCR 檢測成立; 待測樣品出現預期大小的擴增條帶, 判定為 PCR 結果陽性, 根據表1

判定產肉毒毒素梭菌菌株型別, 待測樣品未出現預期大小的擴增條帶, 判定 PCR 結果為陰性。

注: PCR 試驗環境條件和過程控制參照 GB/T27403 的規定執行。

6.3.3.3 實時熒光PCR 鑒定

挑取6.3.3.2 中肉毒毒素編碼基因檢測陽性的菌株進行實時熒光 PCR 鑒定:

a) DNA 模板制備: 見6.3.3.2 的b) 部分。

b) PCR 反 應 體 系: 總 反 應 體 系 體 積 為 25 μL,10 × PCR 緩 沖 液 2.5 μL、 上/下 游 引 物

(10 μmol/L) 各0.8 μL、 探針(10 μmol/L)0.5 μL、dNTPs(2.5 μmol /L)3 μL、Taq DNA 聚合

酶(5U/μL)0.5 μL、DNA 模板1 μL、 滅菌去離子水補足至25 μL。 每個反應均應設置至少2 個

平行。

注: 反應體系中各試劑的量可根據具體情況或不同的反應總體積進行適當調整。 也 能 選 用 含 有 PCR 緩 沖 液、

MgCl2 、dNTP 和Taq DNA 聚合酶等成分基于 Taqman 探針的實時熒光 PCR 預混液。

c) PCR 反應條件:95 ℃ 、10 min( 可根據不同廠家的聚合酶要求調整) ,1 個循環;95 ℃ 、20 s,

60 ℃ 、30 s,72 ℃ 、30 s(FAM 熒光采集) ,45 個循環。

注: PCR 反應參數能根據基因擴增儀型號進行適當調整。

d) 引物和探針序列見表3。

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GB 4789.12—2025

表 3 產肉毒毒素梭菌熒光PCR 檢測引物和探針序列

菌種名稱 基因名稱 引物和探針 序列(5’-3’ ) 序列位置

梭菌屬 16SrRNA

上游引物 GCT CGT GTC GTG AGA TGT T

下游引物 CTC RYT AGA GTS CTC AAC YWA A

探針 FAM-AAY AAY AAG GGT TGC GCT CGT

TGC-BHQ1

GenBank 號: MT279666.1

位置:1 036-1 123

肉毒梭菌 hydA

上游引物 GTG GYA CTA CAA GTA TAG TAG ATC AT

下游引物 GTT GTA TAA CAC CAT GAA AMC CAT AG

探針 FAM-TCG GAC CTA AAG GAT GTG ATT TAC

ACC A-BHQ1

GenBank 號:CP046450.1

位置:3 318 645-3 318 779

丁酸梭菌 hydA

上游引物 ATG GGT TAG GCA AGC AGA AA

下游引物 TCC TTC CAC TGT AGG GTA ATA TG

探針 FAM-CAC CAC AAC AAA TAT TTG GAG

CAG CAA GT-BHQ1

GenBank 號:CP033249.1

位置:3 318 645-3 318 779

e) 對照設置: 檢測過程(包括 DNA 提取) 中, 每個反應均應設置陽性對照、 陰性對照和空白對照。

其中陽性對照模板為擴增片段的陽性克隆分子 DNA 或陽性菌株 DNA, 陰性對照模板為非梭

菌菌株 DNA, 空白對照模板為無菌水。

f) 結果判讀: 陽性對照出現典型擴增曲線,Ct 值<30; 陰性對照無典型擴增曲線或 Ct 值≥40; 空

白對照無典型擴增曲線或 Ct 值≥40。 否則, 結果視為無效。

當待測菌株檢測 Ct 值≥40 時, 判定檢測結果為梭菌屬或某種梭菌陰性; 當待測菌株 Ct 值<30

時, 可判定檢測結果為梭菌屬或某種梭菌陽性; 當待測菌株 Ct 值為30≤Ct<40 時, 應重復試驗, 若重復

試驗結果 Ct 值≥40 則判定為梭菌屬或某種梭菌陰性, 否則, 判定為梭菌屬或某種梭菌陽性。

注: 若肉毒毒素檢測結果為陽性, 實時熒光 PCR 鑒定結果為梭菌屬陽性, 肉毒梭菌和丁酸梭菌均為陰性, 可進一步

檢測菌株是否為其他某種產肉毒毒素梭菌。

6.3.3.4 菌株產毒試驗

將6.3.3.2 或6.3.3.3 檢出的可疑產肉毒毒素梭菌陽性菌株接種庖肉培養基或 TPGYT 培養基, 按

6.3.1.2 條件厭氧培養5 d, 按6.2 的方法進行肉毒毒素檢驗。 毒素確證試驗陽性者, 判定為產肉毒毒素

梭菌。 也可根據毒素定型試驗結果判定梭菌型別。

注: 根據 PCR 陽性菌株型別, 可直接用相應型別的肉毒毒素診斷血清進行毒素確證試驗。

7 結果與報告

7.1 肉毒毒素檢驗結果報告

根據6.2.3 和6.2.4 試驗結果, 報告樣品中檢出或未檢出肉毒毒素。

根據6.2.6 定型試驗結果, 報告樣品中檢出某型別肉毒毒素。

7.2 產肉毒毒素梭菌檢驗結果報告

根據6.3 各項試驗結果, 報告樣品中未檢出或檢出產某型肉毒毒素的某種梭菌。

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附 錄 A

培養基和試劑

A.1 生理鹽水

A.1 .1 成分

NaCl 8.5 g

蒸餾水 1 000 mL

A.1 .2 制法

將 NaCl 加入至1 000 mL 蒸餾水中, 溶解分裝后121 ℃ 高壓滅菌15 min。

A.2 庖肉培養基

A.2.1 成分

蛋白胨 30.0 g

牛肉浸粉 3.0 g

酵母浸粉 5.0 g

磷酸二氫鈉 5.0 g

葡萄糖 3.0 g

可溶性淀粉 2.0 g

蒸餾水 1 000 mL

碎肉渣 適量

A.2.2 制法

將除碎肉渣外的各成分加入蒸餾水中, 攪勻后加熱溶解, 備用。

在20 mm×150 mm 試管中先加入碎肉渣高1 cm~2 cm, 每管加入還原鐵粉0.1 g~0.2 g 或少許

鐵屑, 再加入配制肉湯15 mL, 如厭氧裝置較簡易, 且在有氧環境中操作時間較長, 可向管內加入液體石

蠟覆蓋培養基0.3 cm~0.4 cm,121 ℃ 高壓滅菌15 min, 滅菌后的培養基在25 ℃ 的pH 為7.4±0.1。

A.3 胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉湯(TPGYT) 培養基

A.3.1 基礎成分(TPGY)

胰酪胨 50.0 g

蛋白胨 5.0 g

酵母浸粉 20.0 g

葡萄糖 4.0 g

硫乙醇酸鈉 1.0 g

蒸餾水 1 000 mL

A.3.2 胰蛋白酶溶液

稱取胰蛋白酶(活力1 ∶ 250)1.5 g, 加入 100 mL 蒸餾水中溶解, 使用 0.22 μm 濾膜過濾除菌,

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2 ℃ ~8 ℃ 保存備用。

A.3.3 制法

將 A.3.1 中成分溶于蒸餾水中, 分裝20 mm×150 mm 試管, 每管15 mL, 加入液體石蠟覆蓋培養

基0.3 cm~0.4 cm,121℃ 高壓滅菌10 min, 滅菌后的培養基在25 ℃ 的pH 為7.2±0.1。 2 ℃ ~8 ℃ 冷

藏, 兩周內使用。 臨用接種樣品時, 每管加入胰蛋白酶溶液1.0 mL。

A.4 卵黃瓊脂培養基

A.4.1 基礎培養基成分

酵母浸粉 5.0 g

胨 20.0 g

胰胨 5.0 g

氯化鈉 5.0 g

瓊脂 20.0 g

蒸餾水 1 000 mL

A.4.2 卵黃乳液

用硬刷清洗雞蛋2 個~3 個, 瀝干, 殺菌消毒表面, 無菌打開, 取出內容物, 棄去蛋白, 用無菌注射器

吸取蛋黃, 放入無菌容器中, 加等量無菌生理鹽水, 充分混勻,2 ℃ ~8 ℃ 保存備用。

A.4.3 制法

將 A.4.1 中成分溶于蒸餾水中, 分裝,121 ℃ 高壓滅菌15 min, 滅菌后的培養基在25 ℃ 的 pH 為

7.0±0.2, 冷卻至50 ℃ 左右, 按每100 mL 基礎培養基加入 15 mL 卵黃乳液, 充分混勻, 傾注平板,

36 ℃ ±1 ℃ 培養24 h 進行無菌檢查后,2 ℃ ~8 ℃ 保存備用。

A.5 哥倫比亞血瓊脂培養基

A.5.1 基礎培養基成分

胰酪胨 10.0 g

肉胃蛋白酶水解物 5.0 g

酵母浸粉 5.0 g

氯化鈉 5.0 g

心胰酶消化物 3.0 g

淀粉 1.0 g

瓊脂 13.0~15.0 g

A.5.2 無菌脫纖維羊血

無菌操作條件下, 將綿羊血倒入盛有滅菌玻璃珠的容器中, 沿同一方向連續振搖約10 min, 靜置后

除去附有血纖維的玻璃珠即可。

A.5.3 制法

將 A.5.1 中成分溶于1 000 mL 蒸餾水中, 分裝,121 ℃ 高壓滅菌15 min, 滅菌后的培養基在25 ℃

的pH 為7.3±0.2, 冷卻至45 ℃ 左右, 加入5%無菌脫纖維羊血, 充分混勻, 傾注平板, 備用。

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A.6 明膠磷酸鹽緩沖液

A.6.1 成分

明膠 2.0 g

磷酸氫二鈉(Na2HPO4 ) 4.0 g

蒸餾水 1 000 mL

A.6.2 制法

將 A.6.1 中成分溶于蒸餾水中,121 ℃ 高壓滅菌15 min, 滅菌后在25 ℃ 的pH 為6.2。

A.7 磷酸鹽緩沖液(PBS)

A.7.1 成分

氯化鈉 7.650 g

磷酸氫二鈉 0.724 g

磷酸二氫鉀 0.210 g

蒸餾水 1 000 mL

A.7.2 制法

將 A.7.1 中成分溶于蒸餾水中, 121 ℃ 高壓滅菌15 min, 滅菌后在25 ℃ 的pH 為7.4。

A.8 革蘭氏染色液

A.8.1 結晶紫染色液

A.8.1 .1 成分

結晶紫 1.0 g

95%乙醇 20.0 mL

1%草酸銨水溶液 80.0 mL

A.8.1 .2 制法

將結晶紫完全溶于乙醇中, 再與草酸銨水溶液混合。

A.8.2 革蘭氏碘液

A.8.2.1 成分

碘 1.0 g

碘化鉀 2.0 g

蒸餾水 300 mL

A.8.2.2 制法

將碘和碘化鉀混合, 加入少許蒸餾水充分振搖, 待完全溶解后, 再加蒸餾水至300 mL。

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A.8.3 沙黃復染液

A.8.3.1 成分

沙黃 0.25 g

95%乙醇 10.0 mL

蒸餾水 90 mL

A.8.3.2 制法

將沙黃溶于乙醇中, 再加蒸餾水至100 mL。

A.8.4 染色方法

涂片在酒精燈火焰上固定, 滴加結晶紫染色液覆蓋, 染色1 min, 水洗; 滴加革蘭氏碘液覆蓋, 作用

1 min, 水洗; 滴加95%乙醇脫色15 s~30 s(可將乙醇覆蓋整個涂片, 立即傾去, 再用乙醇覆蓋涂片, 作

用約10 s, 傾去 脫 色 液, 滴 加 乙 醇 從 涂 片 流 下 至 出 現 無 色 為 止) , 水 洗; 滴 加 沙 黃 復 染 液 覆 蓋, 染 色

1 min, 水洗, 待干、 鏡檢。

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